摘 要 目的 探讨内皮细胞特异性分子 -1（ endothelial cell - specific molecule 1,ESM -1） 预处理小鼠骨髓间充质干细胞（ bone marrow - derived mesenchymal stem cells,MSCs） 后改善其生物学特性的机制。方法 通过不同浓度的 ESM -1,对 MSCs 进行预处理，分析其分泌的细胞凋亡相关因子包括肿瘤坏死因子 - α（ TNF - α） 、肿瘤坏死因子 - β（ TNF - β） 和干细胞生长相关因子： 缺氧诱导因子（ HIF） 、转化生长因子（ TGF - β1） 等细胞因子含量的改变情况，以明确 ESM -1 预处理 MSCs 改善其生物学特性的机制。结果 通过不同浓度的 ESM -1 干预 MSCs 后，各浓度组 TNF - α、TNF - β、HIF、TGF - β1 含量随着 ESM -1 干预浓度的升高而升高，各组之间差异有统计学意义（ P =0. 000） .结论 ESM -1 预处理 MSCs 可提高与炎性反应、细胞凋亡和细胞生长分化相关的多种细胞因子的含量，可能通过多种信号转导通路改善 MSCs 的生物学特性。
关键词 内皮细胞特异性分子 -1 骨髓间充质干细胞 小鼠。
Abstract Objective To explore the possible mechanism about improving the biological characteristics of endothelial cell - specificmolecule 1（ ESM - 1） pretreated with mice MSCs. Methods MSCs was pretreated by different concentration of ESM - 1. The possiblemechanism was analyzed about improving the biological characteristics of mice MSCs pretreated with ESM - 1 through analysis of its secre-ted cytokines content. The cytokines include apoptosis related factors: TNF - α and TNF - β； stem cell growth factor related: HIF andTGF - β1. Results After the intervention of MSCs with different concentration of ESM - 1,the content of cytokines levels includingTNF - α，TNF - β，HIF and TGF - β1 increased with the increase of the intervention concentration of ESM - 1. The difference between thegroups was statistically significant（ P = 0. 000） . Conclusion ESM - 1 pretreatment with MSCs can improve the content of many cytokinesrelated to inflammatory response,cell apoptosis,cell growth and differentiation,which may improve the biological characteristics of MSCsthrough a variety of signal transduction pathways.
Key words Endothelial cell - specific molecule 1; Bone marrow - derived mesenchymal stem cells; Mice.
ESM - 1 是具有多种生物学活性的细胞因子。本课题组前期研究证实，ESM - 1 预处理 MSCs 后可提高其存活、增殖能力，增加干细胞移植后的梗死周围心肌组织血管形成[1,2].目前 ESM - 1 改善 MSCs生物学特性的具体机制尚不明确。因此，本实验对其可能机制进行探讨。
材料与方法。
1. 材料： 健康 SD 小鼠； CD29、CD44 抗体（ 北京夏斯生物科技有限公司，prospec cat: SV30010） ; ESM -1 （ Cusabio Biotech 公 司 ） ; TNF - α （ USCN,SEA133Mu） 、TNF - β （ USCN,SEA134Mu） 、TGF - β1（ USCN,SEA124Mu） 、HIF - 1α（ USCN,SEA798Mu） .器械： CO2培养箱（ 上海博讯公司，cat: BC - J160S） ;流式细胞仪（ BD C6） ; 倒置相差显微镜（ 日本 Nikoneclipse Ts100） ; 数字显示隔水式电热恒温培养箱（ 上海跃进医疗器械厂） .
2. MSCs 获取、培养： 取 2 月龄 SD 小鼠，冲出股骨骨髓成单细胞悬液，以 1000r/min 离心 5min.弃上清，用含 100ml/L FBS 的 DMEM 培养基重悬稀释，以（ 1 ~ 5） × 109个/L 的密度接种、培养（ 37℃、50ml/LCO2、饱和湿度） .待细胞 90%汇合时传代，传代至第3 代时的 MSCs 用于实验。
3. MSCs 标志鉴定： 细胞融合达 90% 时，用 2. 5g /L 胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，经 100 目的滤筛过滤，2000r/min 离心 5min.弃上清，用 PBS 制成 2 ×105/ L 的细胞悬液用于实验。细胞悬液分装在 2 支样品管中，分别加入 Anti - mouse CD29、Anti - CD44- FIT; 37℃ 条件下，与细胞悬液反应 20min.加入PBS 1ml 混匀，2000r / min 离心 10min,弃上清。每管再加入 PBS 0. 5ml 制成细胞悬液，经流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD29、CD44 的表达情况。
4. 实验分组： 将 MSCs 接种至 12 孔板，用含有10% FBS 的 DMEM 培养基培养，当细胞培养至覆盖培养基单层时，用 0. 01mol/L PBS 浸洗 2 次，加无血清培养基 1 毫升/孔，形成初级培养液。将 MSCs 随机分为两组，分别接受以下处理： （ 1） 空白对照组： 不进行预处理。（ 2） 观察组： 用 ESM - 预处理，根据ESM - 1 干预浓度，分为 10 个亚组： （ A 0. 2μg / ml、B0. 25μg / ml、C 0. 3μg / ml、D 0. 35μg / ml、E 0. 4μg / ml、F 0. 45μg / ml、G 0. 5μg / ml、H 0. 55μg / ml、I 0. 6μg /ml、J 0. 65μg / ml） ; 每组设 4 个复孔，每孔均处理60min.收集每孔的培养液，检测预处理对 MSCs 分泌细胞因子的影响。
5. 细胞形态学观察： 荧光倒置显微镜下细胞形态观察，明确生长、分化情况。
6. 细胞因子 ELISA 检测： 采用 USCN 公司试剂盒，定量培养液中各细胞因子的含量，按照试剂盒说明的操作进行。检测的细胞因子包括 TNF - α、TNF - β、HIF、TGF - β1.
7. 统计学方法： 数据应用 SPSS 19. 0 统计学软件处理。计量资料采用均数 ± 标准差（ x ± s） 表示。两组间比较采用成组设计的 t 检验，3 组以上比较采用单因素方差分析，两两比较采用 q 检验，以 P < 0. 05为差异具有统计学意义。
结 果。
1. MSCs 标志抗原鉴定： 实验结果显示超过 90%小鼠骨髓间充质干细胞性表达 CD29 （ 细胞整合素分子） 和 CD44（ 黏附分子） ,证实为干细胞（ 图 1） .
