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ESM-1对骨髓间充质干细胞的改善机制探究

来源:医学研究杂志 作者:朱宗成;盛晓东;周建龙
发布于:2017-06-30 共4403字
  摘 要 目的 探讨内皮细胞特异性分子 -1( endothelial cell - specific molecule 1,ESM -1) 预处理小鼠骨髓间充质干细胞( bone marrow - derived mesenchymal stem cells,MSCs) 后改善其生物学特性的机制。方法 通过不同浓度的 ESM -1,对 MSCs 进行预处理,分析其分泌的细胞凋亡相关因子包括肿瘤坏死因子 - α( TNF - α) 、肿瘤坏死因子 - β( TNF - β) 和干细胞生长相关因子: 缺氧诱导因子( HIF) 、转化生长因子( TGF - β1) 等细胞因子含量的改变情况,以明确 ESM -1 预处理 MSCs 改善其生物学特性的机制。结果 通过不同浓度的 ESM -1 干预 MSCs 后,各浓度组 TNF - α、TNF - β、HIF、TGF - β1 含量随着 ESM -1 干预浓度的升高而升高,各组之间差异有统计学意义( P =0. 000) .结论 ESM -1 预处理 MSCs 可提高与炎性反应、细胞凋亡和细胞生长分化相关的多种细胞因子的含量,可能通过多种信号转导通路改善 MSCs 的生物学特性。
  
  关键词 内皮细胞特异性分子 -1 骨髓间充质干细胞 小鼠。
  
  Abstract Objective To explore the possible mechanism about improving the biological characteristics of endothelial cell - specificmolecule 1( ESM - 1) pretreated with mice MSCs. Methods MSCs was pretreated by different concentration of ESM - 1. The possiblemechanism was analyzed about improving the biological characteristics of mice MSCs pretreated with ESM - 1 through analysis of its secre-ted cytokines content. The cytokines include apoptosis related factors: TNF - α and TNF - β; stem cell growth factor related: HIF andTGF - β1. Results After the intervention of MSCs with different concentration of ESM - 1,the content of cytokines levels includingTNF - α,TNF - β,HIF and TGF - β1 increased with the increase of the intervention concentration of ESM - 1. The difference between thegroups was statistically significant( P = 0. 000) . Conclusion ESM - 1 pretreatment with MSCs can improve the content of many cytokinesrelated to inflammatory response,cell apoptosis,cell growth and differentiation,which may improve the biological characteristics of MSCsthrough a variety of signal transduction pathways.
  
  Key words Endothelial cell - specific molecule 1; Bone marrow - derived mesenchymal stem cells; Mice.
  
  ESM - 1 是具有多种生物学活性的细胞因子。本课题组前期研究证实,ESM - 1 预处理 MSCs 后可提高其存活、增殖能力,增加干细胞移植后的梗死周围心肌组织血管形成[1,2].目前 ESM - 1 改善 MSCs生物学特性的具体机制尚不明确。因此,本实验对其可能机制进行探讨。
  
  材料与方法。
  
  1. 材料: 健康 SD 小鼠; CD29、CD44 抗体( 北京夏斯生物科技有限公司,prospec cat: SV30010) ; ESM -1 ( Cusabio Biotech 公 司 ) ; TNF - α ( USCN,SEA133Mu) 、TNF - β ( USCN,SEA134Mu) 、TGF - β1( USCN,SEA124Mu) 、HIF - 1α( USCN,SEA798Mu) .器械: CO2培养箱( 上海博讯公司,cat: BC - J160S) ;流式细胞仪( BD C6) ; 倒置相差显微镜( 日本 Nikoneclipse Ts100) ; 数字显示隔水式电热恒温培养箱( 上海跃进医疗器械厂) .
  
  2. MSCs 获取、培养: 取 2 月龄 SD 小鼠,冲出股骨骨髓成单细胞悬液,以 1000r/min 离心 5min.弃上清,用含 100ml/L FBS 的 DMEM 培养基重悬稀释,以( 1 ~ 5) × 109个/L 的密度接种、培养( 37℃、50ml/LCO2、饱和湿度) .待细胞 90%汇合时传代,传代至第3 代时的 MSCs 用于实验。
  
  3. MSCs 标志鉴定: 细胞融合达 90% 时,用 2. 5g /L 胰蛋白酶消化,制成细胞悬液,经 100 目的滤筛过滤,2000r/min 离心 5min.弃上清,用 PBS 制成 2 ×105/ L 的细胞悬液用于实验。细胞悬液分装在 2 支样品管中,分别加入 Anti - mouse CD29、Anti - CD44- FIT; 37℃ 条件下,与细胞悬液反应 20min.加入PBS 1ml 混匀,2000r / min 离心 10min,弃上清。每管再加入 PBS 0. 5ml 制成细胞悬液,经流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD29、CD44 的表达情况。
  
  4. 实验分组: 将 MSCs 接种至 12 孔板,用含有10% FBS 的 DMEM 培养基培养,当细胞培养至覆盖培养基单层时,用 0. 01mol/L PBS 浸洗 2 次,加无血清培养基 1 毫升/孔,形成初级培养液。将 MSCs 随机分为两组,分别接受以下处理: ( 1) 空白对照组: 不进行预处理。( 2) 观察组: 用 ESM - 预处理,根据ESM - 1 干预浓度,分为 10 个亚组: ( A 0. 2μg / ml、B0. 25μg / ml、C 0. 3μg / ml、D 0. 35μg / ml、E 0. 4μg / ml、F 0. 45μg / ml、G 0. 5μg / ml、H 0. 55μg / ml、I 0. 6μg /ml、J 0. 65μg / ml) ; 每组设 4 个复孔,每孔均处理60min.收集每孔的培养液,检测预处理对 MSCs 分泌细胞因子的影响。
  
  5. 细胞形态学观察: 荧光倒置显微镜下细胞形态观察,明确生长、分化情况。
  
  6. 细胞因子 ELISA 检测: 采用 USCN 公司试剂盒,定量培养液中各细胞因子的含量,按照试剂盒说明的操作进行。检测的细胞因子包括 TNF - α、TNF - β、HIF、TGF - β1.
  
  7. 统计学方法: 数据应用 SPSS 19. 0 统计学软件处理。计量资料采用均数 ± 标准差( x ± s) 表示。两组间比较采用成组设计的 t 检验,3 组以上比较采用单因素方差分析,两两比较采用 q 检验,以 P < 0. 05为差异具有统计学意义。
  
  结 果。
  
  1. MSCs 标志抗原鉴定: 实验结果显示超过 90%小鼠骨髓间充质干细胞性表达 CD29 ( 细胞整合素分子) 和 CD44( 黏附分子) ,证实为干细胞( 图 1) .
  
    
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