磁性纳米颗粒在BMSCs中的封装及其临床应用

　　磁性纳米材料指尺度为 1 ~ 100 nm 的磁性材料，目前以铁系氧化物居多。磁性纳米材料通常在磁性纳米颗粒表面修饰上多种生物大分子或者靶的配体，这样就既具备良好的磁导向性，也具有良好的生物相容性或者靶向性，可与多种功能分子如蛋白质、核酸和维生素等结合，实现磁靶向应用[1].磁性纳米颗粒的应用主要见于： 可作为药物载体，通过外加磁场的作用将药物靶向定位； 可应用于磁共振成像（ MRI） 作为对比造影剂进行体内示踪、细胞筛选、生物分离和基因治疗等。Mah 等[2]将携带有治疗基因的病毒载体包被到磁性载体的表面，当磁性载体到达靶部位时通过体外磁场使其滞留在靶部位，这样可使病毒较长时间接触靶组织，从而增加基因转染和表达的效率。

　　1987 年 Friedenstein 等[3]首次从骨髓中分离获得骨髓间充质干细胞（ BMSCs） ,自此 BMSCs 移植在动物实验和临床应用中得到了重视和发展。BMSCs 在体外特定的诱导条件下或体内特定环境下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、骨髓基质、肌腱及韧带等组织[4].

　　BMSCs 具有定向迁移至损伤部位进行增殖、分化并修复损伤组织的能力[5].BMSCs 取材容易，对机体损伤小，且体外培养简单，细胞扩增速度快，由于自体移植无明显的免疫排斥反应，也不涉及伦理道德问题，具有良好的临床应用前景，因此，目前在组织工程、基因工程等研究中成为理想的种子细胞，在临床疾病的治疗过程中，对骨骼系统疾病、肝脏纤维化、心脏疾病的治疗具有很高的价值[6].

　　随着磁性纳米材料技术的发展与成熟，利用 MRI标记细胞进行活体示踪的研究成为当前热点[7-9].研究者设想将磁性纳米颗粒封装入 BMSCs,在保证BMSCs 生物活性和分化潜能的前提下，在外加磁场的作用下，可实现 BMSCs 在机体内的靶向定位，同时因为磁性纳米颗粒可作为 MRI 的对比增强剂，可以实现BMSCs 的体内示踪，动态观察 BMSCs 的迁移和增殖过程，将磁性纳米颗粒封装入 BMSCs,可以充分发挥两者的优势，因而具有广阔的应用前景。

　　1 磁性纳米材料和 BMSCs 的制备方法

　　1. 1 常见磁性纳米材料制备方法

　　磁性纳米材料一般是铁氧化物，其制备方法通常有干法与湿法。干法是指在比较剧烈的条件下，使铁的配合物分解以得到铁的纳米材料； 湿法包括空气氧化法、共沉淀法、微乳液法及热分解法。目前在有机相中用的最多的是热分解法，在水相中则为共沉淀法。

　　热分解法是指使用高沸点有机溶剂，使铁的配合物在高温下分解，经过氧化和部分还原得到产物[10]; 而共沉淀法是指在液相中将沉淀剂加入到含有铁离子和亚铁离子的溶液中，生成磁性纳米颗粒。

　　1. 2 BMSCs 的制备方法

　　BMSCs 主要存在于骨髓组织中，具有贴壁生长的特性，通过全骨髓贴壁分离的方法，经多次传代，可以获得比较纯净的 BMSCs[11].目前制备 BMSCs 的方法主要有流式细胞仪分离法、免疫磁珠法、贴壁筛选法及密度梯度离心法等[12].其中免疫磁珠法和流式细胞仪法制得的细胞活性低下，操作繁琐，较少使用。目前应用较多的方法是将密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合，即通过离心使成纤维细胞和其他单核细胞分离，接种于培养瓶后，利用 BMSCs 的贴壁生长性，获得足量的 BMSCs[12-14].

　　2 磁性纳米材料对 BMSCs 的影响

　　2. 1 磁性纳米材料进入 BMSCs 的过程和方法

　　多个实验表明，磁性纳米颗粒及细胞膜表面都带负电荷，两者相互排斥，这使得磁性纳米颗粒在自然状态并不能有效地被哺乳动物细胞摄取，标记率低，因此为达到磁性标记细胞的目的，必须通过修饰细胞，再经由吞噬作用、液相胞饮作用、受体介导的吞噬作用和转染作用促进细胞对其摄取。为了将磁性纳米颗粒成功导入 BMSCs,目前常用的方法是使用带正电荷的基团包裹纳米颗粒，基团必须具备生物相容性和可降解性，以避免损伤正常组织。国内学者做了不少相关工作。于春鹏[6]选用带正电荷的转染剂多聚赖氨酸（ PLL,0. 75 μg·ml- 1） ,它包裹带负电荷的纳米颗粒，形成两者的聚合体，更容易穿越带负电荷的细胞膜进入细胞。陈鹏等[10]使用葡聚糖包被的磁性纳米颗粒与 BMSCs 共培养，封装好的细胞增殖和分化能力均与对照组无明显差异，磁性纳米颗粒晶体表面包裹葡聚糖形成的核壳式结构阻止了氧化铁颗粒水溶进程并保护细胞不受 Fe 的毒害，是当前使用比较广泛的一种包被磁性纳米颗粒的方法。陈瀛[15]用接种了氨（ Fe304-Si02-NH2） 的二氧化硅（ SiO2） 包裹磁性纳米颗粒，使得细胞对磁性纳米颗粒的吞噬率大大提高。金旭红等[16]用硫酸鱼精蛋白包裹磁性纳米颗粒，可使纳米颗粒成功进入 BMSCs,同时不影响细胞活性和分化能力。

　　虽然包被纳米颗粒的方法很多，可以使纳米颗粒成功导入 BMSCs,但是包被好的纳米颗粒进入细胞的过程和方式尚不清楚，缺乏相关研究，另外不同研究中纳米颗粒的性质和形态也并不统一。至于 BMSCs 摄取磁性纳米颗粒的过程是否受外加磁场的影响，也未见相关报道。

　　2. 2 适宜的纳米颗粒质量浓度和共同孵育时间

　　关于纳米颗粒标记 BMSCs 的适宜浓度，多个研究。[10,15,17-18]报道所用纳米颗粒的质量浓度有所不同。这可能是不同研究使用的纳米颗粒直径和表面包被的修饰物不同，每个实验室的研究条件也不一样的原因所致。张瑞平等[19]总结前人的研究成果得出纳米颗粒合适的质量浓度是 20 ~50 （ μg Fe） ·ml- 1,此浓度为磁性纳米颗粒的理想标记浓度，此浓度下 BMSCs 标记率高，且纳米颗粒的细胞毒性及其对 BMSCs 的增殖活性影响较小。一般文献报道中常用的超顺磁性纳米铁离子（ SPIO） 标记细胞的浓度通常在 10 ~ 20 μg·ml- 1.最新研究显示，SPIO 有效标记 BMSCs 的最低质量浓度为 15 mg·L- 1[20],在 15 mg·L- 1时，SPIO 对BMSCs 标记效率较高，且不影响其存活、增殖。但对纳米颗粒和 BMSCs 共同孵育的时间基本一致，为18 ~24 h[18-20],时间过短降低了 BMSCs 的标记率，时间过长影响细胞活性。

　　2. 3 磁性纳米颗粒和 BMSCs 结合物 （ 纳米颗粒-BMSCs） 的鉴定方法

　　多个研究[11-15,17-18]证实，在适宜的浓度范围内，磁性纳米材料对 BMSCs 的形态、生长、迁移、成骨分化能力等无明显影响，磁性纳米材料具有良好的生物相容性。鉴定磁性纳米颗粒是否成功标记 BMSCs,以及标记后 BMSCs 细胞的活性和分化能力的方法总结如下。