纤毛的生物学及纤毛病发病机制研究

　　纤毛（也称鞭毛）是突出于真核细胞表面的一类在进化上很保守的细胞器， 由纤毛膜、轴丝及其底部的基体组成。 纤毛广泛分布于原生动物及脊椎动物细胞表面， 负责感受内外环境信号以及驱动细胞运动。 在哺乳动物特别是人类中， 纤毛结构和功能的异常能导致多囊肾， 神经系统发育缺陷， 听觉、嗅觉和视觉的衰退， 呼吸道疾病和不育症等， 这些疾病统称为纤毛病， 其发病率在1/1000左右。 目前还没有治疗纤毛病的药物， 所以对纤毛的生物学及纤毛病的发病机制的研究是目前细胞生物学的一个热点。

　　纤毛是一类极性化细胞器， 它的形成和解聚与细胞周期密切相关。 当细胞退出有丝分裂， 进入静息期（G0）时， 中心体迁移至细胞顶端， 形成基体， 随后微管在基体上组装形成纤毛。 细胞返回有丝分裂前，纤毛解聚， 在G1/S阶段， 纤毛完全消失， 中心粒被释放， 形成微管组织中心促使纺锤体生成。 纤毛的形成和解聚与细胞周期之间是否存在着因果关系目前还不清楚， 但由于纤毛中存在着与细胞周期相关的信号通路， 通过改变纤毛的形成和解聚的速度然后影响细胞周期的进程是可能的。 以前的工作大多数集中在纤毛的形成机理上， 潘俊敏教授从 2004 年就开始关注纤毛解聚的分子机理， 发现了衣藻中类似aurora 的蛋白激酶 CALK（Chlamydomonas aurora-likekinase）和 kinesin-13（CrKin13）参与纤毛的解聚， 并利用 反 向 鞭 毛 内 运 输 机 制 （retrograde intraflagellartransport） 将纤毛解聚的产物由纤毛中运回到细胞体[1~3]. 最近潘俊敏教授实验室在衣藻中筛选得到纤毛解聚突变体 fls1, 提出纤毛解聚分为依赖 FLS1 的解聚阶段和不依赖 FLS1 的解聚阶段， 该研究改变了纤毛解聚的传统理论[2].

　　单细胞衣藻是研究纤毛的经典模式生物， 衣藻鞭毛解聚不仅发生在有丝分裂和减数分裂之前， 也可受外源信号（如 NaPPi）诱导。 fls1 突变体是通过插入诱变筛选得到， 其基因编码一种蛋白激酶。 野生型鞭毛经 NaPPi 诱导 3 h 后解聚消失， 但 fls1 鞭毛此时仅缩短至全长的一半， fls1 鞭毛完全解聚需要 4.5 h.野生型鞭毛解聚的速度恒定为 0.068 ?m/min, 而 fls1鞭毛的解聚分为两个阶段， 前 3 h 的解聚速度为0.029 ?m/min, 3 h 后解聚速度恢复至 0.077 m/min.

　　同样在有丝分裂前， fls1 的鞭毛解聚也表现为两个阶段， 第一阶段鞭毛解聚速度仅为 0.08 ?m/min, 当鞭毛缩短至一半以后， 解聚速度恢复至野生型水平， 该突变体的有丝分裂周期也较野生型延迟约 2 h. 基于上述分析， Hu 等人认为鞭毛解聚过程依据鞭毛长度分为两个阶段， FLS1 在前一阶段的解聚中发挥功能[2].这些结果也表明通过改变纤毛解聚的速度来影响细胞周期的进程是可能的。

　　FLS1 蛋白在结构上与哺乳动物细胞周期蛋白依赖性类似激酶 CDKL（cyclin-dependent kinase-like）亚家族相似， 具有与 cyclin 结合的结构域。 免疫荧光显示， FLS1在鞭毛的基体附近有聚集， 在鞭毛内也有分布。 当 NaPPi 处理 5 min 或者正负配子混合 3 min,FLS1 即发生磷酸化， 而此时鞭毛还未观察到明显的缩短迹象， 说明 FLS1 的磷酸化是对诱导解聚的初始信号做出的响应。 野生型胞体内激酶 CALK 在 NaPPi处理 10 min 内即发生磷酸化， 而在突变体 fls1 中CALK 在 90 min 后鞭毛缩短至 10 ?m 时才被磷酸化，说明 FLS1 可能作用于 CALK 的上游。 另一方面， 野生型鞭毛缩短时， CrKin13 会立即被 IntraflagellarTransport 运送至鞭毛参与微管解聚， 但是 1 h 后鞭毛缩短至 6~7 ?m 时野生型鞭毛中部分 CrKin13 会发生磷酸化， 从而部分抑制 CrKin13 的微管解聚活性。

　　在 fls1 的鞭毛中， CrKin13 磷酸化的时间提前至 10min, CrKin13 的微管解聚活性提前得到抑制。 FLS1 的缺失可能导致 CALK-HDAC6（histone deacetylase 6）和 CrKin13 两种途径对微管解聚的贡献均被抑制， 因而纤毛的解聚变慢。 上述分析说明， 鞭毛解聚的新调控因子 FSL1既是鞭毛缩短时 CALK磷酸化的正向调控元件， 也是 CrKin13 磷酸化的负向调控元件。

　　最近几年利用衣藻、利什曼虫、四膜虫和哺乳动物模型证明了 CALK, aurora A, kinesin-13（KIF2A），HDAC6 和 NIMA（never-in-mitosis gene A）激酶的磷酸化在纤毛解聚中起到很重要的调控作用[3~5]. 在 FSL1依赖型解聚的过程中， FSL1 的磷酸化可能受到来自细胞膜、纤毛或细胞核的调控， 然后活化微管去乙酰化酶HDAC6, 磷酸化的HDAC6进入纤毛， 去除微管上的乙酰化修饰， 以利于轴丝的解聚。 FSL1还可能在鞭毛内间接去除 CrKin13 的磷酸化， 提高 CrKin13 对微管的解聚活性（图 1A）。 在不依赖于 FSL1 的解聚过程中， CALK 的活性受到其他蛋白或因素的调节， Hu等人[2]认为是鞭毛的长度。 CrKin13 在纤毛中存在磷酸化和非磷酸化这两种形式， 由于这两种形式对微管的解聚活性存在差异， 轴丝解聚的速度可以通过这两种形式的比例来进行调节（图 1B）。

　　正如其他重要的发现一样， 纤毛解聚两阶段模型引出许多有趣的新问题： 一是两阶段纤毛解聚的生理意义是什么？ Hu 等人[2]认为远端纤毛的解聚产生细胞从 G1 期进入 S 期的信号， 而近端鞭毛解聚的信号促使中心粒的释放。 另一种可能是纤毛对外界信号感受和细胞周期调控非常重要， 因此纤毛的解聚受到严格的调控， 纤毛还可在解聚至一半时立即重新形成完整的纤毛。 这两种解释都需要实验来证实； 二是两阶段解聚模型是否有纤毛结构的证据支持， 远端纤毛与近端纤毛的结构是否存在差异？衣藻鞭毛微管二联体具有钳状结构， 这种结构仅存在于近端轴丝， 而且只有近端的微管蛋白会发生谷氨酰胺化修饰， 另外有些蛋白如调控鞭毛长度的蛋白激酶 LF5 特异性定位于纤毛的近端。 下一步实验需要证明这些结构和蛋白定位的改变是否影响纤毛解聚的速度； 三是鞭毛中可能存在着新的鞭毛解聚方式， 因为在 fls1 突变体中， 鞭毛依然能够缓慢解聚至一半长度。 其他有趣的问题还包括轴丝的解聚如何与纤毛膜的解聚同步， 泛素化等其他的翻译后修饰是否参与到这个过程以及外界信号如何调控 FLS1 的磷酸化等。 Hu 等人的工作为回答以上问题打下了很好的基础， 将会促进纤毛解聚领域的发展。

　　参考文献

　　1 Pan J, Wang Q, Snell W J. An aurora kinase is essential for flagellar disassembly in Chlamydomonas. Dev Cell, 2004, 6: 445–451

　　2 Hu Z, Liang Y W, He W, et al. Cilia disassembly with two distinct phases of regulation. Cell Rep, 2015, 10: 1803–1810

　　3 Pugacheva E N, Jablonski S A, Hartman T R, et al. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell,2007, 129: 1351–1363

　　4 Miyamoto T, Hosoba K, Ochiai H, et al. The microtubule-depolymerizing activity of a mitotic kinesin protein KIF2A drives primary ciliadisassembly coupled with cell proliferation. Cell Rep, 2015, 10: 664–673

　　5 Blaineau C, Tessier M, Dubessay P, et al. A novel microtubule-depolymerizing kinesin involved in length control of a eukaryotic flagellum.Curr Biol, 2007, 17: 778–782