基因修饰的间充质干细胞在组织损伤修复中的研究

　　间充质干细胞（ Mesenchymal stem cells,MSCs）是成体干细胞的一种，具有多向分化潜能。来源广泛，可从多种组织中分离得到，易于体外扩增培养，应用不涉及伦理问题，副反应少，安全性较高，在组织修复和再生方面的临床应用前景广阔。目前间充质干细胞已用于对多种疾病的治疗研究中，例如心肌梗死[1]、糖尿病[2]、阿尔茨海默病[3]、自身免疫性疾病[4]等。由于 MSCs 易于被如逆转录病毒，慢病毒，腺病毒等载体转染，在体外将目的基因克隆至这些载体上，对 MSCs 进行感染，可以使目的基因在MSCs 中高表达。
　　
　　越来越多的研究利用 MSCs 作为外源基因的载体，高效过表达某种细胞因子，用以提高 MSCs 的治疗效果。经过基因改造的 MSCs,其归巢能力、体内生存能力和分化能力得到增强，可以利用 MSCs 对炎症部位和肿瘤组织的归巢特性治疗多种疾病。综述了基因修饰的 MSCs 在组织损伤修复，放射性损伤和肿瘤治疗中的研究进展，并对其在临床上的应用前景进行了展望。

　　1 间充质干细胞的生物学特性

　　MSCs 最初是在骨髓中发现的，现在则可以从多种组织中分离得到，包括脐带[5],脐带血[6],外周血[7],胎儿的肝和肺[8],脂肪组织[9],骨骼肌[10],羊水[11],滑膜[12]等。其中人脐带中的华通氏胶（ Wharton's jelly） 是 MSCs 的一个丰富来源[5].

　　MSCs 被定义为多能性干细胞，即可以分化形成多种组织细胞，如成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，腱细胞和肌细胞等[13,14].在合适的培养条件下还可分化为肝细胞样[15]和神经细胞样细胞等[16].无论MSCs 的来源如何，都可以自我复制，在实验室的培养中可传至很多代而不失去自我更新能力[17].因此可以将它们进行大量的体外扩增，用于组织和器官修复。

　　为了更好的定义人 MSCs,国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会制定了人 MSCs 的最低标准[18]: ①MSCs 在标准培养条件下呈贴壁生长； ②表达 CD105,CD73 和 CD90,不表达 CD45,CD34,CD14或 CD11b,CD79α 或 CD19 和 HLA - DR; ③MSCs 在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞分化。除了多向分化潜能外，MSCs 还能调节免疫和炎症反应。MSCs 同时具有通过旁分泌信号释放生物活性分子的修复功能，可以影响细胞迁移，增殖和周围细胞的生存等[19].MSCs 的这些功能使得其具有了强大的临床应用潜力。

　　2 基因修饰的间充质干细胞的应用

　　MSCs 的免疫原性低，并且能够在重复注射后都不被受者的免疫系统识别[20],这是 MSCs 用于临床治疗的一个最显着的优势。MSCs 还能够分泌很多生物活性分子[21]以及一些免疫调节因子，能够对机体的损伤、炎症等起到修复作用。目前，MSCs 被用于治疗多种疾病的临床试验，包括多发性硬化症，心肌梗死，器官移植，肝硬化及肝衰竭，心衰，GVHD,左心室功能失调，白血病及克罗恩病等[22].

　　MSCs 还是非常理想的基因治疗细胞载体，易被所有临床上普遍应用的病毒载体系统所转染，经过基因修饰的 MSCs 输注后可以遍布全身，不仅可以发挥干细胞归巢和修复的作用，同时又可大量表达如细胞因子等的目的基因，而且二者具有协同作用，这样可以扩大 MSCs 治疗的疾病范围，使得病灶部位局部的修复几率大大提高。这些优点使得 MSCs成为最具有基因治疗研究和临床治疗应用前景的干细胞之一。

　　2. 1 基因修饰的间充质干细胞在组织修复中的应用 目前，基因修饰的 MSCs 的研究主要集中于提高 MSCs 自身特性介导的对各种组织的修复能力。

　　一旦研究人员发现某种细胞因子对受损组织有益，他们就会通过基因工程的方法使 MSCs 过表达这些因子用于治疗。很多实验结果证明经过基因修饰的MSCs 明显较未修饰的 MSCs 在组织修复中更加有效。Zhang 等[23]用腺病毒将人肝细胞生长因子HGF 导入人 MSCs 中，然后在慢性心肌缺血的模型猪体内进行心内移植，发现 HGF - MSC 可以分化为血管内皮细胞，并整合到发育中的脉管系统中，降低室性心律失常的敏感性。通过重组腺病毒使 MSCs过表达神经营养因子 BDNF 或 GDNF 都可以修复大鼠短暂性大脑中动脉闭塞造成的缺血性损伤，修复大鼠受损的中枢神经系统[24],提示基因修饰的MSCs 可用于对中风的治疗； 基因修饰的 MSCs 在修复肾脏损伤方面也有文献报道，Eliopoulos 等[25]发现用红细胞生成素 EPO 对小鼠骨髓来源的 MSCs 进行基因修饰，可以改善肾功能衰竭继发性贫血模型小鼠的贫血症，并缓解慢性肾衰的症状； 另外，经过基因修饰的 MSCs 也被用于修复骨损伤[26],经过骨形态形成蛋白（ bone morphogenetic protein 2） BMP2重组腺相关病毒感染 MSCs,并用含有 α -4 整联蛋白基因质粒瞬时转染，可以提高 MSCs 的归巢性，增加小鼠的骨密度和骨矿物质含量； mHCN2 是一种心脏起搏蛋白，将瞬时转染了含有 mHCN2 基因质粒的 hMSCs 注入模型狗的左心室，可使左侧心脏进行自发的有节律的跳动[27]; 用重组腺病毒在 MSCs 中过表达 CXCR4 蛋白或与 SDF -1α 共同过表达都可以显着提高心梗模型大鼠的心脏功能[28].

　　2. 2 基因修饰的间充质干细胞在治疗放射性损伤中的应用 核辐射事故、核恐怖袭击和战争爆发情况下可能产生大量的急性辐射损伤（ acute radiationsyndrome,ARS） 人群。另外，在恶性肿瘤的治疗中，放射性治疗手段不可避免地会对患者造成放射性损伤。大量的电离辐射引发的 ARS 是对神经与血管系统、造血系统及胃肠等造成损伤的全身性疾病。

　　将基因修饰的 MSCs 用于治疗辐射性损伤近几年成为辐射损伤治疗领域的新方向。

　　2009 年，Abdel - Mageed 等[29]首次报道了用表达细胞外超氧化物歧化酶（ extracellular superoxidedismutase） 的重组腺病毒 Ad5CMVECSOD 感染小鼠骨髓来源的 mMSCs,发现注射了 ECSOD - mMSCs的 ARS 小鼠中52%存活了35d 以上，但是对照组只有 9%,PBS 组只有 10% 的小鼠存活了 35d 以上。

　　2013 年，Xue 等[30]构建了表达 TGF - βII 型受体的重组腺病毒 Ad - sTβR,将其转染 MSCs 用于治疗小鼠胸部辐射导致的肺损伤，将治疗组生存率提高了40% ,组织病理切片显示 Ad - sTβR - MSCs 治疗组的肺泡厚度下降，Ad - sTβR 转染的 MSCs 能够明显地迁移到肺部辐射损伤部位。Zhang 等[31]用编码HGF（ Hepatocyte growth factor） 和 HGF - shRNA 的慢病毒感染 ADSCs.SD 大鼠经60Gy 辐照诱导肝损伤后给予治疗。2d 后，观察到 HGF - ADSCs 治疗组与对照组相比肝细胞凋亡情况明显减少，肝细胞再生能力明显增强。且通过下调 α - SMA 和纤维连接蛋白减少了放射性诱导的肝纤维化。

　　2015 年 4 月，Gan 等[32]用重组腺病毒作为载体表达 ECSOD3,感染人脐带来源的 MSCs.经重组腺病毒 Ad - ECSOD3 感染 hUCMSC 后，细胞培养液上清中 ECSOD3 的活力与对照组相比提高了 3 倍。治疗组小鼠的外周血白细胞、血小板、红细胞和血红蛋白水平与对照组相比都有明显上升。在小鼠经亚致死剂量辐射后的 1h 和 48h 尾静脉注射重组腺病毒Ad - ECSOD3 感染的人 UCMSC.AVSOD3 - UCMSC和 AVSOD3 - BMMSC 组小鼠 30d 的生存率为提高了约 30%.说明 AVSOD3 - UCMSC 和 AVSOD3 -BMMSC 都可以有效治疗急性辐射损伤。

　　2. 3 基因修饰的间充质干细胞在肿瘤基因治疗中的应用 MSCs 具有肿瘤归巢能力，能迁移到肿瘤组织部位与肿瘤结缔组织融合。在肿瘤微环境中会产生慢性炎症，MSCs 会灵敏的探测到肿瘤组织周围的这种损伤，内源性的骨髓或脂肪来源的 MSCs 以及静脉输注的 MSCs 都会迁移到肿瘤部位。因此可以将 MSCs 作为肿瘤基因治疗的载体高效地向肿瘤部位传递肿瘤治疗的基因或药物，靶向性地治疗肿瘤[33].另外，由于 MSCs 的免疫原性低，异体的MSCs 在体内可以逃避免疫系统的清除，能够进行多次给药，使得同种异体 MSCs 用于肿瘤治疗成为可能。

　　将 MSCs 作为抗肿瘤基因的载体对肿瘤能够起到抑制作用已经有多篇文献报道[34-36].由于细胞因子在体内的半衰期很短，如果直接单独应用细胞因子进行肿瘤治疗的话，在体内会很快被降解，而且可能也会对正常细胞产生毒副作用。如果采用细胞因子基因修饰的 MSCs 进行治疗的话就可以避免上述情况。MSCs 会迁移到肿瘤局部释放细胞因子，因此会在肿瘤部位提高因子的浓度，并且显着降低对正常细胞的毒副作用。如果 MSCs 是用病毒载体进行修饰的，那么 MSCs 会在肿瘤部位持续释放细胞因子，仅一次治疗就可以起到长效作用。现在用于修饰 MSCs 治疗肿瘤的基因主要有白介素类，干扰素类，前药类，溶瘤病毒类促凋亡蛋白类，生长因子拮抗剂类，抗血管增生蛋白等。

　　同时，也有研究表明，低剂量的未经基因修饰的MSCs 在体内可以促进免疫反应，而高剂量或过量的未经修饰的 MSC 迁移到肿瘤部位也可能会促进肿瘤生长[37].目前，对于未经修饰的 MSCs 在肿瘤微环境中对肿瘤究竟是起到抑制作用还是促进作用还存在一些争议，这也是现在 MSCs 的一个研究热点。

　　对这一现象有研究指出，MSCs 的来源不同和异质性也许是它对肿瘤具有不同作用的主要原因。MSCs介入肿瘤的时间和细胞剂量可能也是其究竟起到哪方面作用的直接因素。但是到目前为止，用于临床治疗的 MSCs 还未见有导致形成肿瘤的报道。将MSCs 进行抗肿瘤因子的基因修饰或许可以克服其在体内可能具有的致瘤性这一缺点[38].

　　3 结语与展望

　　目前 MSCs 及基因修饰的 MSCs 移植对组织损伤和对辐射导致的机体损伤，及对肿瘤的治疗尚未经过临床试验的验证，大多只限于动物实验，迄今为止，还未见到临床治疗方面的相关报道。如何更好地利用基因修饰的 MSCs 治疗相关疾病还有待深入研究。MSCs 在治疗过程中的组织损伤的修复机理、MSCs 的最佳治疗时机、最佳细胞数量等问题尚无定论。各种来源的 MSCs 在生物学特性方面和不同来源的 MSCs 经基因修饰后的疗效差别等还有待进一步明确。基因修饰对于 MSC 的治疗作用有何影响，其疗效和机制尚待阐明，上述问题均是进一步研究MSCs 作为生物治疗细胞和载体的重要内容。

　　2015 年 2 月 26 日，国家科技部发布了《国家重点研发计划干细胞与转化医学重点专项实施方案》（ 征求意见稿） ,启动了国家重点研发计划"干细胞与转化医学"重点专项试点工作。这一方案的出台预示着间充质干细胞治疗将迎来新的春天。随着分子生物学等技术在 MSCs 基础研究中的不断深入和相关机理问题的解决，基因修饰的 MSCs 的治疗研究将有望取得新的突破。