磁性纳米颗粒在BMSCs中的封装及其临床应用(2)

　　2. 3. 1 磁性纳米颗粒成功标记 BMSCs 的鉴定方法

　　2. 3. 1. 1 普鲁士蓝铁染色 成功标记的细胞内部可看到蓝染颗粒，标记率 = 蓝染细胞数/细胞总数。张旭等[17]发现，磁性纳米颗粒进入 BMSCs 后主要积聚于细胞质中，可见大量蓝染颗粒，部分聚集成团，颗粒分布以核周和靠近细胞膜处较为明显，细胞核中没有蓝染颗粒。

　　2. 3. 1. 2 透射电镜检查 以正常的 BMSCs 作为对照，成功标记的 BMSCs 细胞质中可观察到高密度电子颗粒，进入的纳米颗粒越多，高密度颗粒数量越多。

　　2. 3. 2 磁性纳米颗粒-BMSCs 生长活性的鉴定方法2. 3. 2. 1 台盼蓝染色法 将纳米颗粒-BMSCs 的细胞悬液与台盼蓝染色液以 9∶ 1 的比例混匀，静置3 min,光镜下计数，死细胞为蓝色，活细胞不着色，以正常的BMSCs 作为对照，计数 200 个细胞，计算活细胞百分比。

　　2. 3. 2. 2 细胞计数试剂盒（ CCK-8） 法 将标记磁性纳米颗粒的 BMSCs 制成细胞悬液，外加正常细胞的空白对照组，按每孔 100 μl 接种于两块 96 孔板中，每组每天 3 个复孔。培养 24 h 后第 1 天测量组每孔加入10 μl CCK-8 溶液，将培养板放入细胞培养箱中继续培养，测量标本 450 nm 处的吸光度值（ A 值） .根据公式： 细 胞 抑 制 率 = （ A实验组- A阴性对照组） /（ A实验组-A空白对照组） ×100%,计算纳米颗粒对细胞的抑制率。

　　2. 3. 2. 3 测量生化指标法 乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，主要存在于机体所有组织细胞的胞质内，当细胞膜的完整性受到破坏时，胞浆内的乳酸脱氢酶会溢出，因此测定上清液中的乳酸脱氢酶活性可以很好地反映细胞膜受损伤的程度，与细胞死亡数目成正比[21].另外，也可测量超氧化物歧化酶（ SOD） 的含量来判断细胞的活力。超氧阴离子自由基是生物体内正常的代谢产物，SOD 的主要功能是催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧，可清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受伤害，因此 SOD 值可反映细胞抵抗氧化损伤的能力[22].

　　2. 3. 2. 4 四甲基偶氮唑盐（ MTT） 比色法[8,15,17,23]将纳米颗粒标记的 BMSCs 的细胞悬液接种于 96 孔板，以未标记的 BMSCs 作为空白对照，用酶标仪在490 nm处侧出 A 值，并与对照组对比。

　　2. 3. 3 磁性纳米颗粒-BMSCs 分化能力的鉴定方法

　　2. 3. 3. 1 茜素红染色法[23]在纳米颗粒-BMSCs 组和正常 BMSCs 组中均加入成骨诱导液，观察细胞形态的变化，分化的细胞中间可见圆形与卵圆形钙化结节，茜素红染色可见桔红色钙盐沉积。

　　2. 3. 3. 2 测定 BMSCs 细胞上清液中的碱性磷酸酶活性 对不同时间段纳米颗粒-BMSCs 组和正常 BMSCs组上清液按碱性磷酸酶检测试剂盒操作说明进行酶联免疫检测，测定 A 值，计算两者差异有无统计学意义。

　　3 摄取有磁性纳米材料 BMSCs 的临床应用

　　3. 1 骨骼系统

　　3. 1. 1 椎间盘突出

　　Sakai 等[24]用绿色荧光蛋白标记的自体 BMSCs移植入成年家兔退变髓核中，结果显示，植入的细胞可以增辅并且表达出一些髓核细胞的特征性表型，髓核内蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达水平明显上调，两者均为细胞外基质的重要组成成分。Zhang 等[25]将兔同种异体的 BMSCs 注射入兔的椎间盘，与未注射组和注射盐水组在 1、3、6 个月时分别检测 mRNA、蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量，结果显示注射 BMSCs 组均明显增加。鲍军平等[12]以家兔为实验对象，证实 BMSCs 对椎间盘尚未突出但髓核已改变的椎间盘同样有效。

　　3. 1. 2 股骨头坏死（ ONFH）

　　ONFH 是骨科常见难治性疾病，早期多用药物和物理治疗，晚期以人工关节置换为主，患者病程长、痛苦多、医疗花费大。BMSCs 具有多向分化能力，移植入体内的 BMSCs 分化后可替换已经坏死的细胞，这为ONFH 的治疗提供了一种全新的思路和方法。 在ONFH 病例中，BMSCs 的数量及成骨活性均有明显的下降[26].对 116 例坏死的股骨头行髓芯减压，同时抽取自体骨髓血，体外分离、浓集后植入骨坏死区域，即通过细胞移植治疗 ONFH,对早期 ONFH 取得优良效果[27].孟增东等[13]证实了 SPIO 标记的 BMSCs 与未标记的 BMSCs 原位移植治疗兔 ONFH 有着同样疗效。

　　3. 2 肝脏

　　BMSCs 在肝细胞生长因子的诱导下可以分化为正常肝细胞，已有报道将自体移植的 BMSCs 用于重型肝炎和晚期肝硬化的治疗，取得了良好效果。于春鹏[6]用 PLL 标记的磁性纳米颗粒-BMSCs,通过 MRI观察 BMSCs 在大鼠肝纤维化模型中的定位情况，证实了 BMSCs 在大鼠体内可分化为肝细胞，同时为 BMSCs的增殖分化提供了影像学支持。

　　3. 3 其他疾病

　　张瑞平等[14]证实 BMSCs 移植对家兔急性重症胰腺炎（ SAP） 有一定治疗效果，同时通过 MRI 进行了细胞示踪，为 SAP 提供了一种新的治疗思路和方法。另外，使用不同的磁性纳米颗粒标记 BMSCs,将标记细胞移植到梗死的心肌内进行 MRI 在体内显像的研究，证明标记细胞可以在常规心脏显影，并与组织学检查有良好的一致性[15].这表明 BMSCs 在体内可以迁移到心脏，至于是否能顺利分化为心肌细胞，什么时候分化，需要什么条件，未见相关研究报道。有研究证实BMSCs 可改善足细胞融合，促进足细胞再生，理论上为治疗糖尿病肾病提供了一种新的手段[28].

　　4 存在的问题和未来的研究趋势

　　BMSCs 的研究已经持续了 30 多年，在成功标记磁性纳米材料后，通过外加磁场和 MRI 技术的应用，BMSCs 的靶向定位和体内的迁移、示踪等问题迎刃而解，实现了对 BMSCs 的动态观察。纳米材料的引入为BMSCs 研究带来了飞跃性发展，但同时也有很多问题仍待解决： （ 1） 该研究仍处于动物试验阶段，缺乏人体试验的数据，应用于临床尚需时日； （ 2） 相关的机制和作用过程仍不清楚，例如纳米颗粒进入 BMSCs 的具体过程和作用机理，BMSCs 在体内的定向迁移和分化，以及如何人为控制细胞分化的过程和结果等； （ 3） 进入机体后，BMSCs 的自行分化问题； （ 4） BMSCs 中的磁性纳米颗粒随着细胞的分裂逐渐减少，渐渐失去靶向性和定位能力，影响长期观察[24]; （ 5） 引入磁场后，正常的生理活动是否会受影响。未来的研究重点是 BMSCs 的分化过程和机制，具体的分化时机和结果，若能实现人为控制，将是向临床应用迈出的重要一步。另外，要找到合适的方法，提高磁性纳米颗粒对 BMSCs 的封装效率，满足可以作为长期定位和示踪的要求。同时要引入外加磁场，观察外磁场对纳米颗粒对 BMSCs 的颗粒摄取、迁移、分化等行为有何影响，为将来细胞的靶向定位打下坚实基础。

　　5 总结和展望

　　医学科学研究的最终目的是应用于临床治疗。BMSCs 具有多向分化的潜能，是组织工程学的重要种子细胞； 磁性纳米材料的出现，是生物材料领域的重大突破； 将磁性纳米材料封装入 BMSCs,可以充分发挥两者的优势，具有广阔的发展前景。目前该项研究尚有一些问题需要解决和优化。可以预见，不远的将来，封装有磁性纳米颗粒的 BMSCs 将会大大促进组织工程学和临床医学的发展，为广大患者带来福利。

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