浅析小凹与小凹蛋白对成骨细胞的影响

　　近年来，小凹和小凹蛋白成为生物膜和细胞生物学领域的一个新热点，越来越受到国内外学者的关注。 尤其是当今社会，科学技术飞速发展，交通工具日新月异，交通伤害防不胜防，颌面部创伤的诊治和修复显得越来越重要，学者们对颌面部成骨修复研究也越来越多。 成骨细胞中的小凹和小凹蛋白在成骨过程中的作用也越来越受到关注，本文简要概括了成骨细胞中的小凹和小凹蛋白的相关作用。

　　1 小凹（Caveolae）及其蛋白质家族。

　　1953 年，Palade 第一个用电子显微镜观测到心脏连续内皮细胞上亚细胞结构 Caveolae,并以“质膜囊泡”（plasmalem-mal vesicles）命名。 随后，张勤勤等[1]在胆囊上皮细胞中也发现了类似的凹陷的“窝”状结构。 细胞质膜微囊即小凹（Caveo-lae）也称作陷窝是一类 50 ~ 100 nm 大小的细胞膜上呈长颈瓶样内陷入胞浆的细胞膜亚单位结构[2-3],其含有小蛋白质（18~ 24 kDa），由小凹蛋白基因家族编码 ,在哺乳动物中主要是Caveolin-1（Cav-1）、Caveolin-2（Cav-2）、Caveolin-3 （Cav-3）[4-6],Cav-1 由在跨物种序列高度保守的三个外显子组成 ,有两个亚型：178 个残基的 Cav-1a 和 147 个残基的 Cav-1b,它们来自一个内部翻译起始位点 Met32[7]. Cav-2 是由三个外显子编码的 162 个残基的蛋白质组成，与 Cav-1 的基因序列高度相似。Cav-2α 是完整的蛋白质，已确定有两种其他亚型[8],但是没有特异性。 Cav-3 是由两个外显子编码的 151 个残基的蛋白质组成[9]. 在小鼠中这 3 个基因定位于 6 号染色体上；在人类中，Cav-1 和 Cav-2 基因定位到染色体位点 7q31.1 的D7S522 的遗传标记，其中包括已知的脆弱点附近 （FRA7G），Cav-3 定位到 3p25. 尽管假设 Cav-1 和 Cav-2 源自基因重复， 但 Cav-1 和 Cav-3 却具有高度一致的氨基酸序列[10].

　　Cav-1（也称为 Caveolin 或 VIP21）是小凹结构的基础和标志蛋白，也是第一个被确定为小凹的结构部件和运输高尔基体衍生的囊泡的家庭成员。 根据细胞类型的不同，Cav-1 可能有可溶性细胞质形式以及分泌形式[5,11]. Cav-1 广泛表达 ,在脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成骨细胞及多种上皮细胞中高水平表达[10].

　　Cav-2 和 Cav-3（也称为 M-caveolin）比 Cav-1 后发现。

　　Cav-2 与 Cav-1 常共表达，而 Cav-3 主要表达在横纹肌细胞[5,11].大多数的小凹在细胞和组织中的形成只需要 Cav-1 表达，而Cav-2 的缺失并不影响小凹本身的形成 , 最近的研究表明Cav-2 在 Cav-1 依赖的小凹动力学和专门的小凹蛋白功能中有一定的作用[12]. 另一方面，在骨骼肌细胞和心肌细胞中的小凹主要由 Cav-3 形成[10].

　　小凹和小凹蛋白参与囊泡运输、细胞内外钙稳态、胆固醇稳态和内吞作用[5,11]. 此外，它们还在信号转导、细胞增殖和肿瘤进展中发挥重要作用[12-13]. 从功能上看，小凹和小凹蛋白对于区室化和各类信号分子（包括受体和非受体酪氨酸激酶，血管内皮型一氧化氮合酶，和小 GTP 酶等）的浓度以及干扰下游许多蛋白质和癌基因蛋白（如 c-Src、H-Ras 和增殖作用蛋白激酶等）的活性和信号转导至关重要[5-6,11]. 最近的研究也表明，小凹蛋白可以独立发挥他们的作用，无论是在有小凹的细胞（如心肌细胞和成纤维细胞），还是那些缺乏小凹的细胞（如神经元和白细胞）中发挥作用[14]. 因此，这些发现表明，小凹蛋白功能的实现不一定依赖于小凹的存在，这些蛋白质可能发挥与他们相关的小凹以外的和其他相关的生物学作用。同时，也可以根据需要重建小凹来恢复小凹依赖的相关功能，如用全长 PTRF-CAVIN 转染重建小凹结构[15].

　　由于小凹和小凹蛋白的普遍存在性和组织的差异表达，小凹蛋白对于正常细胞和组织的生理非常重要，并参与调控多种人类疾病。 如小凹可以影响成骨细胞、破骨细胞等细胞的各种生理活动从而调控人体骨量稳态，小凹蛋白可以用于某些恶性肿瘤的辅助诊断等[16-17].

　　2 小凹和小凹蛋白-1（Caveolin-1）与成骨细胞。

　　成骨细胞中存在大量的小凹结构[18],它主要表达 Cav-1和 Cav-2[19],小凹结构是刺激感受装置和信号集成平台，它能浓缩并区室化信号分子，对信号传播、放大甚至可以为各种信号因子之间的交换沟通创造局部环境[20],其中，Cav-1 的分布最为广泛，是形成小凹结构的主要分子基础和功能蛋白。 在成骨细胞中，小凹及 Cav-1 在其成骨过程中起着重要作用。

　　正常小鼠和人的成骨细胞高水平的表达 Cav-1 和 Cav-2,而检测不到 Cav-3 的表达[21-23],从功能上看，Cav-1 对成骨细胞的生理学影响和功能似乎比 Cav-2 有更为密切的联系，Cav-2 不介导小凹的内陷， 与 Cav-1 相比，Cav-2 只能与很少的分子发生相互作用[24]. 因此，在成骨细胞和骨组织中几乎没有 Cav-2 的相关研究，而到目前为止，大多数研究都聚焦在 Cav-1 及其如何影响成骨细胞分化、增殖、矿化等方面。

　　一些实验研究表明，Cav-1 可以通过调节内皮型一氧化氮合酶的酶活性作为成骨细胞的一个调节器。 这种酶引起的一氧化氮的产生，是成骨细胞功能调节的重要介质，其定位于小凹结构中 Cav-1 脚手架域[23]. 通过与内皮型一氧化氮合酶结合，Cav-1 可以调节一氧化氮的产生， 从而调节成骨细胞的活性。 同时，在成骨细胞的小凹中发现一些 Cav-1 丰富的膜信号复合体，如生长因子受体、Src 家族和丝裂原活化蛋白激酶信号通路酪氨酸激酶，可被 Cav-1 进行分选、加工、修饰进而在成骨细胞的生长和分化中发挥相应的作用[25]. 其次，Cav-1 可以通过多条胞内信号转导通路 （如 MAPK/ERK、eNOS/NO、Wnt/β-catenin 等）调节成骨细胞的分化成熟。

　　Rubin 等[25]发现 Cav-1 有助于骨祖细胞保持低分化状态，而它的缺失会导致骨成熟更迅速。 换句话说，Cav-1 可以调节细胞内信号向骨祖细胞传递， 选择性的阻止这些信号引起的成骨细胞分化。 Boyan 等[26]发现饲养 8 周的 Cav-1沉默的小鼠生长板形态特征发生改变， 包括骨小梁细胞过度增多且细胞肥大。 提示 Cav-1 成骨细胞的增殖分化中有一定作用（图 1）。 Janet 等[27]通过 Cav-1 沉默的小鼠模型研究发现，其骨骼大小和劲度都有所增强，说明 Cav-1 在骨代谢中具有重要作用。 此外，也有证据表明 Cav-1 基因参与调控成骨细胞介导的细胞外基质的钙化。 Rubin 等[25]还发现Cav-1 沉默的小鼠虽然具有正常的骨骼性状 , 但在骨小梁内皮质骨的尺寸增大，坚硬的细胞外基质大量沉积。 这些数据表明，Cav-1 抑制骨基质矿化，与它抑制对成骨细胞分化的影响一致 （图 1）， 但其具体作用机制依然不明。 然而，Sawada 等[24]研究强调 Cav-1 在骨矿化中发挥的作用是很复杂的。 他们的研究表明，在小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 中，当Cav-1 过表达时 ,矿化增强 ,这个结论与上面的讨论完全相反。 Serra 等[10]发现，在小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 中，Cav-1以膜基质囊泡的形式分泌，释放在细胞外基质，增加成骨细胞的分化。 在小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 中，沉默 Cav-1 会减少基质囊泡形成， 表明分泌型 Cav-1 与增强骨细胞钙化相关的膜基质囊泡的形成密切相关（图 1）。 即 Cav-1 可以作为脂蛋白颗粒分泌到细胞外。 我们推测， 胞浆中分泌型Cav-1 可以不通过小凹结构而作为膜基质囊泡直接参与和直接影响一些信号途径， 从而独立的对成骨外基质的钙化起着一定促进的作用。

　　2.1 雌激素/植物雌激素与 Cav-1.

　　成骨细胞分化为骨细胞经过了增殖、分化及矿化等三个不同时期， 雌激素对这些阶段均有不同程度的正性调节作用，多条信号转导途径介导了雌激素对成骨细胞分化相关基因表达的调控。 近年研究表明，雌激素除通过经典的胞浆/核雌激素受体（ER）途径之外，还可以通过胞膜 ER 信号途径如内皮型一氧化氮合酶（eNOS/NO）等途径调节成骨细胞的分化成熟，并在整体实验中得到证实。

　　该研究发现胞膜 ER、eNOS 等信号分子和激酶均存在于的小凹结构中， 雌激素对于增殖和矿化期小鼠成骨细胞MC3T3-E1 中 Cav-1 蛋白表达无明显影响， 但可以剂量依赖性下调分化期细胞 Cav-1 表达，即 Cav-1 可以负性调控雌激素对分化期小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 的促分化作用[28].8-Prenylnaringenin（8-PN）是迄今发现活性最强的植物雌激素，其改善实验性绝经后骨质疏松的作用已有报道。 该研究发现，8-PN 具有同雌激素类似的调节 Cav-1 对成骨细胞分化影响的作用， 提示植物雌激素 8-PN 可促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1 的 分化成熟 , 其促成骨细胞分化作用可能与Cav-1 途径有关[29].

　　2.2 PTRF/cavin-1 与 Cav-1.

　　PTRF/cavin-1 在各种细胞中均高表达， 包括脂肪细胞、成骨细胞和肌肉（心脏、骨骼、平滑肌）细胞。PTRF/cavin-1 和磷脂酰丝氨酸具有高结合亲， 从而促进其掺入小凹结构；在小凹中，PTRF/cavin-1 位于 Ω 形的细胞质膜微区，有研究证实，PTRF/cavin-1 的丢失会导致小凹结构的减少， 改变膜内组织信号通路，这可能会导致细胞行为改变[30]. 同时，PTRF/cavin-1 与小凹的形成有关[30],其在小凹中大量存在 ,并 且与Cav-1 共 分布于小凹 （位于小凹的胞浆侧 ）中和细胞骨架蛋白有着密切的联系[31-32]. 新 近研究表明 ,小凹蛋白与 PTRF/cavin-1 在细胞的迁移中起重要的作用， 提示 PTRF/cavin-1可能在 Cav-1 和小凹的上游介导细胞的迁移。 而过度表达PTRF/cavin-1 或者下调 PTRF/cavin-1 的表达能引起 Cav-1 表达量相应的改变[33].

　　有研究表明 PTRF/cavin-1 可以改变前列腺癌细胞来源的细胞外小泡和内化衰减外囊泡介导的成骨细胞和破骨细胞增殖[15]. 但其具体作用途径、作用效应与机制还不明确，尤其是在前列腺癌的研究中，成骨细胞和破骨细胞在前列腺癌发生发展中的作用等相关问题还有待进一步探讨。 同时，相关研究还指出 PTRF/cavin-1 和 Cav-1 共定位与小凹结构，直接与细胞骨架网络相互作用， 形成 Caveolae-caveolin-1-PTRF/cavin-1 这样一个相互沟连的极为复杂的调控系统，为细胞内外各种信号分子、信号通路等提供了一个交换沟通的大型分子平台。 目前，这方面的研究主要在心血管系统中的血管平滑肌方面[33],而在成骨细胞中还未见相关报道，因此我们可以对其进行进一步的深入研究。