基因克隆论文（精编版范文8篇）

　　如今“克隆”已成为一个全球性的敏感问题。所谓基因克隆，就是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA进行体外重组,获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白。基因克隆技术的应用给社会带来了极大的挑战。本文整理了8篇“基因克隆论文范文”，如下：

　　基因克隆论文（精编版范文8篇）之第一篇：基因克隆技术及其进展研究

　　摘要：基因克隆技术,又称重组DNA技术,是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA进行体外重组,获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白,以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。最近,随着非编码RNA的发现,这项技术也用于RNA的研究。基因克隆技术从发明到现在经历了三个发展阶段。第一个阶段是20世纪70年代初经典的基因克隆技术的创建[1,2]。经典的基因克隆技术是需要限制性内切酶和连接酶的克隆方法,至今仍被广泛应用。第二个阶段是20世纪90年代初不依赖连接酶的克隆方法的出现[3]。这种方法不需要连接酶的参与,不受限制性内切酶的限制,使得基因克隆更加灵活。第三个阶段是21世纪初将重组酶运用到基因克隆中[4],使基因克隆更加强大,靶向性更强,操作更简便。本综述从基因克隆技术发展的这三个阶段入手,概述各项方法的原理和特点,方便人们根据自己的需求选择合适的基因克隆方法。

　　关键词：基因克隆,技术,进展

　　1依赖连接酶的克隆方法

　　1.1需要限制性内切酶和连接酶的克隆方法——平末端克隆和粘性末端克隆

　　这是最为传统、最为经典的基因克隆方法,也是目前仍然被广泛使用的克隆方法,特别是粘性末端克隆法。它是利用限制性内切酶能识别并酶切特异DNA序列的特性,使目的DNA片段和载体产生平末端或粘性末端,然后在DNA连接酶的作用下,将酶切后的目的DNA片段和载体连接成重组DNA分子。该方法需要限制性内切酶和连接酶的参与,而且受限制性内切酶酶切位点的限制和连接酶效率的影响。平末端克隆操作简便,但是克隆效率却很低,而且克隆非定向性,即会出现基因的反向插入和正向插入两种可能。粘性末端克隆需要在目的片段5' 末端引入相对应的酶切位点,而且酶切效率会影响克隆效率。粘性末端克隆具有定向性,但是对于长片段来说,其克隆效率也是比较低的, 甚至片段越长,克隆效率越低。

　　1.2不需要限制性内切酶,只需要连接酶的克隆方法——TA克隆和异质交错克隆技术

　　经Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中大多数的3' 末端会带一个A尾,与3' 末端有一个T突出的线性载体(T载体)会发生互补连接,从而产生重组克隆。此克隆方法操作简单、快速,同一T载体可以与任何3' 末端带A尾的PCR产物连接,通用性非常强,应用相当广泛。 后期有研究人员对TA克隆也进行了一些改进,产生一种变异的TA克隆方法(T载体变为平末端载体),其实也可以认为是一种平末端克隆方法。这种方法既有平末端克隆的简便性,又有TA克隆的克隆效率,特别适合Pfu DNA聚合酶扩增的PCR产物。这种平末端PCR产物可以在拓扑异构酶I的作用下直接插入平末端载体中产生克隆[5],无需对平末端PCR产物另外进行加A尾处理。Invitrogen公司的TOPO-TA就是一例。

　　异质交错克隆技术是另一种只需连接酶的克隆方法。这种方法需要两对PCR引物,对同一目的片段进行两次PCR扩增,第一次PCR的上游引物5' 端引入GGG,第二次PCR的下游引物5' 端引入GGG,两次PCR产物变性、退火后获得4个DNA片段,将此4个DNA片段与3' 末端GGG突出的载体连接,以获得目的片段的重组质粒。Liu[6]通过实验比较TA克隆与异质交错克隆两种方法,发现后者的克隆效率更高。

　　2依赖修饰酶的克隆方法

　　这类克隆方法不受限制性内切酶酶切位点的限制,而是用一些DNA修饰酶使目的基因和载体分别形成较长(十几个至几十个碱基)的互补的3' 或5' 突出末端,通过互补的突出末端间的退火互补复性而达到DNA重组。相对于第一阶段的克隆方法而言,这些方法从一个新视角进行体外重组DNA,克服了低连接效率和受限制性内切酶酶切位点限制的问题,使得基因克隆更加灵活,更具有可操控性, 因而被许多研究者用于质粒构建中[7,8,9]。

　　2.1不依赖连接反应的克隆方法

　　这种方法是Aslanidis和de Jong于1990年创建的[3]。 这两位科学家提出克隆可以不需要限制性内切酶和T4DNA连接酶,而是利用具有3'→5' 核酸外切活性的T4DNA聚合酶分别处理目的片段和载体的PCR产物,产生12 nt的5' 突出互补末端,利用突出的互补末端之间的退火复性进行基因克隆。在设计PCR引物的时候,使目的片段5' 端的12个碱基不含d CMP,线性载体5' 端的12个碱基不含d GMP;在T4 DNA聚合酶处理的时候,处理目的片段中加入d GTP,处理载体过程中加入d CTP,以阻止T4 DNA聚合酶酶切过度。随后还有其他DNA修饰酶运用于此方法中。Hsiao[10]将具有3'→5' 核酸外切活性的核酸外切酶III处理PCR产物30 s ~ 1 min。2010年Clontech公司推出 了融合克 隆体系 ( In-Fusion Cloning ) 使用In-Fusion专利酶处理PCR产物15 min。这两种方法均是通过限制修饰酶处理PCR产物的时间来防止酶切过度。还有一种处理PCR产物的方法便是先后用 λ 核酸外切酶和Klenow酶(3' → 5'exo-)处理PCR产物。λ 核酸外切酶能够沿5' → 3' 方向逐步切除5' 单核苷酸,待退火杂交后, 再用Klenow酶(3' → 5'exo-)修补留有的缺口。Tseng[11]曾经使用此方法处理PCR产物以获得重组DNA。

　　2.2尿嘧啶-DNA糖基化酶克隆法

　　尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase,UDG) 可选择性识别含有d U的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键,水解去除DNA上的尿嘧啶残基。基于LIC法的原理,利用尿嘧啶-DNA糖基化酶能选择性地降解DNA中d UMP这一特性进行不依赖连接反应的克隆实验[12,13,14]。他们在PCR引物5' 端引入一段12 nt的同源序列,此序列中的d TMP被d UMP所取代。使用此引物扩增出来的目的片段与载体,经尿嘧啶-DNA糖基化酶水解后会产生一3' 突出互补末端。同源互补的3' 突出末端退火后即可形成重组质粒。为了进一步提高克隆效率,2003年NEB公司用USER酶取代尿嘧啶-DNA糖基化酶,推出了USER Friendly克隆试剂盒[15]。他们使用USER(uracil-specific excision reagent)酶处理PCR产物。USER酶是一种特异性切割尿嘧啶的酶,是尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶VIII的混合酶。UDG催化尿嘧啶碱基的切除, 形成一个AP位点(脱嘧啶位点),但保持了磷酸二酯键骨架的完整性,不会使DNA分子断开[16,17];核酸内切酶VIII既有N-糖基化酶的活性又有AP位点裂解酶的活性,能特异性地结合在脱嘧啶位点处,并裂解该位点的3' 端和5' 端磷酸二酯键骨架[17,18]。完整的磷酸二酯键骨架会影响3' 突出互补末端的质量,增加DNA重组的困难,而USER酶的使用则有利于单链互补突出末端的形成,大大提高了重组效率。但是DNA链上d U的存在会影响高保真DNA聚合酶的延伸,因此该方法出现后并未被广泛关注。2006年,Nour-Eldin等[15]将Pfu Cx DNA聚合酶运用于其中,很好地解决了这个问题。尽管后期仍然有研究者将USER酶运用于基因克隆中[19,20],但是一些高保真DNA聚合酶与USER克隆法之间的不协调影响着USER酶在基因克隆中的推广。

　　2.3不依赖序列和连接反应的克隆方法

　　Li和Elledge[21,22]于2007年建立的一种既不依赖DNA序列也不依赖连接反应的克隆方法。该方法的实验原理与不依赖连接反应的克隆法基本相同,同样是利用PCR技术扩增具有几十个碱基同源末端的目的片段与载体,并用具有3' → 5' 核酸外切活性的T4 DNA聚合酶处理PCR产物,产生5' 突出互补末端。只是此方法是通过加入d CTP以终止T4 DNA聚合酶的外切作用来防止酶切过度。另外, 传统的不依赖连接反应的克隆法需要额外附加一些缺失d GTP或d CTP的序列,在T4 DNA聚合酶处理PCR产物的同时加入d CTP或d GTP;然而,不依赖序列和连接反应的克隆方法则无需添加多余序列,在T4 DNA聚合酶处理PCR产物后加入d CTP以终止反应。

　　2.4基于硫代磷酸化修饰的不依赖连接酶的克隆方法(PLIC)

　　PLIC也是一种既不依赖DNA序列也不依赖连接反应的克隆方法,其基本原理也是不依赖连接反应克隆法的基本原理。但是,研究者们使用不同方法处理PCR产物,产生单链突出末端。2010年,Blanusa等[23]用碱性的碘/乙醇溶液处理PCR产物,以切断碱基之间的硫代磷酸键,从而产生单链突出末端。另外,还有其他研究者将DNA修饰酶运用于其中,产生单链突出互补末端。Nikiforov等[24]用T7核酸外切酶处理PCR产物;Liu和Liu[25]用 λ 核酸外切酶处理PCR产物。当这些核酸外切酶5' → 3' 逐个水解底物DNA遇到硫代磷酸化修饰碱基的时候,这种硫代磷酸化修饰能够阻止核酸外切酶对底物的水解[26,27]。

　　该方法因不需要依赖连接酶的连接反应而大大提高了克隆效率;同时它又不受限制性内切酶酶切位点的限制,因而使基因克隆更加灵活。PCR产物经修饰酶处理后的简单退火复性,去除了经典限制性内切酶克隆法的繁琐操作,简化了步骤,节省了时间。但是不依赖连接反应的克隆方法要求控制好修饰酶对PCR产物末端的处理,以防酶切过度或不够,利用不同修饰酶的特性以及控制处理时间是目前研究者采取的措施。使用不依赖连接反应的克隆方法,特别是不依赖序列和连接反应的克隆方法,能够同时拼接多个DNA片段,并做到无缝拼接。这就为长片段基因的克隆提供了一种思路。目前,市场上Clonetech的In-Fusion克隆体系和金斯瑞公司的Clone EZ克隆试剂盒就是基于此原理,不受限制性内切酶的限制,目的片段与载体的重组能够在半小时之内完成,重组速率快且效率高,特别适合于基因的高通量克隆。而且此试剂盒也可以做到不添加多余序列,达到多个DNA片段的无缝克隆。不足之处在于必须使用此克隆试剂盒中配套的专利酶,增加了基因克隆的成本。

　　3依赖重组酶的克隆方法

　　21世纪初,Invitrogen公司推出的Gate Way技术将重组酶引入体外基因克隆中,产生了位点特异性DNA重组技术[4]。该技术通过借助特异位点重组酶识别载体和外源DNA上的重组酶特异识别位点,并催化其断裂和重接,从而将目的基因克隆到目标载体上。位点特异性重组技术的运用使基因克隆更加高效、快捷、靶向性强,能将目的基因克隆到一个或多个目标载体中,能够运用于原核生物、酵母、 昆虫、哺乳动物等不同宿主的表达载体中,适合大量基因的高通量克隆。但是这种克隆方法需要特定的重组位点和重组酶的存在,有的重组反应还需要一些辅助因子的参与,而且现成的可供选择的载体有限且贵。这些均增加了使用该方法构建质粒的成本。

　　3.1GateWay技术

　　Gate Way技术涉及到一个 λ 噬菌体重组酶系统(λ 整合酶Int、λ 切除酶Xis、大肠杆菌IHF因子)、四个特定重组位点(att B、att P、att L和att R)及其所发生的两个重组反应(BP反应和LR反应)[4,28,29]。引入att B位点的目的片段PCR产物,与具有att P位点的入门载体发生BP位点特异性反应,形成入门克隆,同时使得入门克隆产生att L位点;含有att L序列的入门克隆又可以与任何带有att R序列的目的载体发生LR位点特异性重组反应,产生最终的目的克隆(图1)。该方法功能强大,克隆效率高, 已经被广 泛应用于 高通量载 体的构建 中[30,31,32]。 但是Gate Way技术没有去除目的克隆中的重组酶特异识别位点,使得目的克隆的表达蛋白携带有额外氨基酸,也无法实现多个DNA片段的无缝克隆。

　　3.2GoldenGate技术

　　为了克服Gate Way技术的这一不足,Engler等[33,34]将II型限制性内切酶加入其中产生了Golden Gate技术。 该技术在形成入门克隆的时候引入一个II型限制性内切酶的酶切位点,这个酶切位点正好在重组酶特异性识别位点与外源DNA序列之间。经过这一步位点特异性重组反应后,紧接着将装入入门克隆中的外源DNA序列转入目标载体(已经预装有同一限制性内切酶酶切位点)的步骤只是通过对入门克隆与目标载体的酶切与连接反应完成DNA重组,获得目的克隆。

　　Golden Gate技术在去除目的克隆中的重组酶特异识别位点的同时引入了限制性内切酶酶切位点,并且要求入门载体和目标载体具有同一限制性内切酶酶切位点,增加了选择限制性内切酶酶切位点的难度。如果该酶切位点选择得当, Golden Gate技术还能同时进行多个DNA片段的克隆。

　　3.3一步LR重组法

　　2008年,Fu等[35]简化了Gate Way技术,使其从两步重组反应变为一步重组反应,使得Gate Way技术操作更为简便。设计PCR引物时直接引入att L特异识别位点,与带有att R特异识别位点的目标载体发生位点特异性重组反应,一步LR重组反应就是将目的基因装载到目标载体中。当目的基因不必装载入多个目标载体的时候可以选择该方法,而且因其操作简便,特别适合于大量基因的高通量克隆。

　　Golden Gate技术与一步LR重组法都是在Gate Way技术的基础上发展演变出来的,都只是一步重组反应。但是, Golden Gate技术是通过一步重组反应形成入门克隆,入门克隆与目标载体之间的目的基因的转载却是在限制性内切酶和连接酶的作用下完成的。一步LR重组法是仅仅通过一步重组反应将目的基因与目标载体重组产生目的克隆,无需限制性内切酶和连接酶的介入。

　　3.4通用载体质粒融合系统克隆法

　　上面提及的3种位点特异性重组方法是依赖 λ 噬菌体整合酶的重组反应,通用载体质粒融合系统却是P1噬菌体Cre/Lox P重组系统的位点特异性重组。与 λ 整合酶的重组反应不同的是Cre/Lox P重组系统只需要Lox P位点和识别Lox P位点的Cre重组酶,不需要其他蛋白因子的参与。Liu等[36,37]建立的这个方法使用两个载体(p UNI载体和p HOST载体)和两个Lox P位点(分别存在于p UNI和p HOST载体序列中)。目的基因先克隆到p UNI载体中产生p UNI克隆,然后在重组酶Cre的作用下,p UNI克隆与p HOST载体发生Lox P位点特异性重组,最终形成目的克隆。Clontech公司的Creater克隆试剂盒就是基于此原理产生的。

　　小结

　　基因克隆技术自从20世纪70年代创建以来,经历了三个发展阶段,从经典的限制性内切酶克隆法到不依赖连接反应的克隆方法,最后到位点特异性重组技术,使基因克隆更加强大、高效、灵活、简便快捷、靶向性更强,加快了蛋白质功能研究的步伐,促进了分子生物学的进步,推动了整个生物学、医学和药学等多个领域的发展。

　　基因克隆技术发展至今已出现多项技术。这些克隆技术各有特色,人们可以根据自己的需求选择简便、易操作的方法。现将三个发展阶段克隆技术的基本原理总结在图1中, 并将这些克隆技术的特点总结在表1中。经典的限制性内切酶克隆法是最为传统的方法,目前仍被广泛使用,因其受限制性内切酶酶切位点的限制以及连接酶连接效率的影响, 它特别适合小片段DNA克隆。不依赖连接酶的克隆方法和位点特异性重组技术因不受限制性内切酶酶切位点的限制以及连接酶连接效率的影响而越来越受青睐。大量基因的高通量克隆和大片段DNA克隆可以考虑选择这些方法。 尽管如此,现在对于大片段DNA的克隆,特别是复杂结构的大片段DNA的克隆,仍然是个难点,需要发明更为高效、简便的克隆方法。

　　基因克隆论文（精编版范文8篇）之第二篇：菠萝DNA克隆技术及研究进展

　　摘要：笔者综述了DNA克隆技术在菠萝上的研究应用, 主要从菠萝花发育相关基因的克隆研究、菠萝果实发育相关基因的克隆研究、菠萝表观遗传相关基因的克隆研究、菠萝抗逆相关基因的克隆研究等方面进行阐述, 以期为今后菠萝DNA克隆技术的研究应用提供参考资料。

　　关键词：DNA克隆技术,表观遗传,抗逆

　　菠萝是凤梨属 (Ananas) 凤梨科 (Bromeliaceae) 多年生常绿草本热带亚热带果树, 16 世纪末至17世纪初传入中国海南、广东、广西、福建等南方地区[1]。菠萝在世界热带水果中产量仅次于柑橘和香蕉, 居第三位[2]。21 世纪以来, 随着生命科学迅猛的发展, 应用分子生物学技术手段进行有关菠萝的研究工作已不新鲜, 而分子生物学应用较多的是分子标记和基因工程[3]两大方面, 相关的报道层出不穷。相对于前两者, DNA克隆技术在菠萝研究中的应用上显得较少, 而DNA克隆技术对菠萝品种改良、种质资源创新利用起着关键作用, 是分子生物学研究中非常重要的一项技术。为此笔者对近年来DNA克隆技术在菠萝中的应用, 如菠萝花发育相关基因的克隆研究、菠萝果实发育相关基因的克隆研究、菠萝表观遗传相关基因的克隆研究、菠萝抗逆相关基因的克隆研究等角度进行综述, 为菠萝DNA克隆技术的发展提供帮助。

　　1 菠萝花发育相关基因的克隆研究

　　开花是植物生殖生长过程的关键, 是环境因素与遗传因素互相作用的结果。其开花过程中涉及大量的基因表达和调控。如MADS-box基因、FVE基因在开花时间调节、花形态建成等方面发挥着不可替代的重要调控作用。为了阐明植物花器官发育的分子遗传机理, 根据对拟南芥[4]和矮牵牛[5]等植物花器官的研究, 阐述了花器官发育ABC模型[6,7], 而现代主流的ABCDE模型就是由其演化而来的[8]。A、B、C、D、E分别表示不同的花器官基因, 独立或多重控制花器官的发育。萼片的发育受A类基因控制, 花瓣的发育是由A类和B类基因互作的结果, 雄蕊的发育是由B类和C类基因共同作用, 而E类与其余4 类基因协同作用, 拮抗作用表现在A类和C类基因之间[9,10]。

　　植物中不可或缺的开花诱导途径包括自主途径 (automous pathway) , FVE是植物自主开花途径中的关键基因, 与RNA和染色质修饰有关[11]。FVE, 又称At MSI4, 是自主途径中的一个关键调节因子。通过与其他功能蛋白形成多亚基复合物, 对控制植物开花调控的关键基因进行修饰, 调控其表达并控制花发育过程。同时, FVE也是ACG1 的等位基因, 具有交叉调控植物反应和开花的双重功能[12]。同时, 可与FCA蛋白协同作用共同沉默环境温度感应途径中一直因子SVP的表达, 促进拟南芥开花。FVE在花发育调控和环境信号影响过程中发挥着不可替代的作用。菠萝开花调控机理一直是经久不衰的课题[13]。菠萝的自然开花是受营养生长和生殖生长共同做用的影响, 虽然低温度和短日照能促进植株开花[14]。但菠萝对日照长短和温度高低要求并不是非常敏感, 表明菠萝可能是通过自主途径促进自体开花。菠萝自主开花在调控菠萝花发育进程中也参与一些技术信号的转导[15,16,17]。研究分析表明, FCA蛋白也是脱落酸 (ABA) 的受体蛋白, 当与ABA结合后会影响FY编码的因子。从而抑制FLC的表达。

　　2 菠萝果实发育相关基因的克隆研究

　　果实的发育情况如何, 呼吸作用起着不可替代的作用, 而呼吸作用又可分为跃变型和非跃变型2类。西红柿属于典型的呼吸跃变型物种, 呼吸跃变与乙烯合成通路和MADS盒转录因子具有典型的相关性[18,19]。详细研究了编码乙烯合成通路中的信号分子的机理作用[20]。在非呼吸跃迁型水果中, 例如葡萄[21]、草莓[22]、西瓜[23]等, 对其果实发育和成熟有关基因做了大量研究, 故克隆和研究非呼吸跃迁型果实成熟基因显的较为重要。Moyle等[24]第1 次构建了菠萝果实不同发育时期的c DNA文库并登陆了1548 个EST序列。

　　利用DNA克隆技术分析已构建的菠萝果实不同发育时期的c DNA文库, 检索、拼装同源性基因序列, 用RT-PCR验证目的基因并对其进行分析, 预判其不同的理化特性, 研究该基因在果实发育过程中的时空表达。

　　3 菠萝表观遗传相关基因的克隆研究

　　通过改变染色体构型以便调控基因的表达, 从而达到控制菠萝表观遗传的目的, 组蛋白去乙酰化酶 (histone deacety1ases, HDACs) 在维持染色质核小体组蛋白乙酰化的平衡中起着关键作用, 可与其他蛋白形成多亚基辅助阻遏物复合体, 导致染色质凝集, 进而抑制基因的表达[25,26]。

　　表观遗传调控和信号转导的重要基因HDACs采用克隆技术和分子生物信息学手段进行分析, 同时分析该基因内在的表达规律, 为进一步了解组蛋白去乙酰化酶基因在调控菠萝表观遗传过程中的生物学功能性状奠定基础。

　　4 菠萝抗逆相关基因的克隆研究

　　笔者以菠萝锌指蛋白 (Zinc finger protein) 为例介绍菠萝抗逆基因的克隆研究进展, 锌指蛋白顾名思义, 是蛋白质与Zn2+结合形成稳定结构, 在基因表达调控、生命形成过程[27], 尤其是抗逆基因表达中起着重要作用[28]。锌指蛋白是转录基因, 是DNA结合蛋白[29]。锌指蛋白基因的表达量在子房、 花瓣和小花中的表达量明显高于其他器官, 对调控菠萝开花具有重要的贡献[30,31]。最近的研究表明, 锌指蛋白基因与干旱、低温、高盐等非生物逆境胁迫因子密切相关, 通过提高基因的表达量, 从而达到提升抗逆性。故而, 菠萝锌指蛋白基因在其逆境胁迫应答中发挥重要作用。再者, 部分植物锌指蛋白基因的表达水平还受ABA的诱导, 如拟南芥AZF2[32]和水稻Os ZFPl[33]等。受外源ABA胁迫诱导后, 锌指蛋白基因在菠萝体内的表达水平也明显提高, 可参与有赖于ABA的信号转导途径。锌指蛋白基因中的Ac RCHYl是菠萝中第1 个报道的C3HC型兼CHY型锌指蛋白基因。结合Ac RCHYl蛋白构造、性能预判和表达特征的分析结果表明, Ac RCHYl可能作为一个锌指蛋白基因在菠萝受低温、 高盐和渗透胁迫过程中, 参与依赖ABA的信号转导途径。

　　5 展望

　　菠萝长片段DNA的研究, 依赖于DNA克隆技术的高速发展, 已成为菠萝分子生物学研究的重要环节之一, 打开了单基因研究到多基因研究的转化。DNA克隆技术对基因功能研究起着很大的推进作用。菠萝DNA克隆技术的应用可以有效地带动菠萝种质资源的创新利用, 随着分子生物学技术的进一步发展, 将会有更多的目的基因被克隆, 高丰度的遗传信息对基因的定位克隆和分子辅助育种等具有重要的指导意义。许多科研工作者在菠萝DNA克隆技术的研究中取得了可喜的成就, 展现了广阔的发展潜力, DNA克隆技术是从事菠萝研究工作的重要方向之一。

　　参考文献
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