基因工程疫苗下游工艺以包涵体形式表达

　　摘要：以大肠杆菌为载体进行蛋白表达的工艺研发虽然技术成熟, 但由于表达产物不同, 所需要的工艺研发存在很大差异。下游纯化工艺的好坏对于疫苗产量、质量、效果有着直接影响。本文探讨了以包涵体形式表达的基因工程疫苗下游工艺, 以供参考。

　　关键词：基因工程疫苗; 包涵体; 纯化; 工艺;

　　基因工程技术构建的重组蛋白, 通常分为可溶性重组蛋白和不溶性重组蛋白, 可溶性的重组蛋白一般存在于细胞质内, 不可溶性的蛋白主要是由于表达系统的高效表达, 在细胞内形成了包涵体, 包涵体是大肠杆菌细胞内错误折叠的蛋白质形成的致密的聚集体。由于外源蛋白表达在细胞内表达过快, 蛋白质没有正确的折叠, 在包涵体内形成了蛋白质聚集体, 但是具有类似于天然蛋白的二级结构, 详见图1。包涵体的回收需要对细胞进行裂解, 常用方法为超声、高压匀浆或研磨等, 通过增加破碎功率、延长时间来减少细胞碎片。另外, 破碎前处理的好坏对破碎效果也有十分重要的作用, 如在高压匀浆前进行酶处理等。存在的杂质可在细胞破碎后通过高速离心或者过滤等方式去除, 从而获得高纯度的包涵体。包涵体颗粒内部主要含有外源表达的目的蛋白, 同时也存在少量的宿主蛋白、核糖体元件或片段。通过洗涤包涵体和整合细胞破碎达到优化下游程序的目的。

　　图1 包涵体表达过程

　　尽管以包涵体形式存在的外源蛋白会增加下游工艺的处理难度, 但对目的蛋白的下游纯化也具有很大的优势。主要表现为:一是蛋白质能获得高表达, 在细胞内所占比例较高;纯化方法更加快捷方便;提高了蛋白质稳定性, 不易被细胞内蛋白酶降解;包涵体表达的目的蛋白的纯度高, 有些可省略精纯步骤。通过以上分析, 重组蛋白通过包涵体的方式进行表达也是商业化蛋白生产的另一手段。获得商品化的蛋白质需要经过以下步骤:细菌的培养、收集、破碎、包涵体的获得、包涵体的溶解变性、纯化和复性。在这些步骤中, 包涵体的溶解、纯化和复性是提高蛋白回收率的关键。

　　1细菌的收集

　　在实验室试验阶段, 少量细菌的收集, 多采用小型离心机就可以满足试验要求, 但在生产过程中, 大批量的产物使得实验室级别的离心机无法满足生产需要, 虽然市场上有连续流离心机, 但是由于技术参数、离心力、能耗、前期投入等多方面因素的限制, 使得其无法在中试或大生产中得到广泛的应用与推广。随着工艺技术要求的逐步提高, 切向流过滤 (TFF) 系统目前正在进入生产工艺。对于会快速堵塞死端过滤仪器的分离液体来说, 切向流过滤是一种有效的解决方法。使用切向流过滤时, 大多数处理液会顺着膜表面流动, 而不是通过膜结构, 液体会以与膜表面平行的相对较高的速度被泵送出。除了水处理应用外, 顺着膜表面的切向流只有一小部分会被渗透。比如, 在多数细胞和颗粒分离中, 只有1%~5%进样到膜设备的流量会成为渗透液, 剩下的95%~99%会退出膜设备成为“保留”。保留液会再循环至处理容器和组件入口, 其中的1%~5%会再作为渗透液被移除, 再循环处理以快速连续的方式进行, 产生一个显著、持续的渗透率。详见图2。

　　图2 切向流过滤

　　而传统的筛网 (或死端) 过滤主要由以下步骤组成:用力使含有悬浮颗粒的溶液直接穿过膜结构, 被膜保留的固体收集在膜介质的表面, 渗透率不断降低, 并最终堵塞仪器。详见图3。

　　图3 传统筛网过滤

　　本研究在细菌的分离过程中, 采用了切向流过滤与离心相结合的方法使菌体的收集达到工艺要求, 同时切向流中空纤维过滤系统还应用了蛋白质的复性、浓缩和液体置换的工艺步骤。

　　2 包涵体的分离

　　大肠杆菌经发酵后, 表达的外源蛋白多以稳定的包涵体形式存在于细胞质中, 实验室多采用超声破碎法将其提取出来, 但由于量的限制, 生产工艺一般采用高压均浆破碎, 破碎后大肠杆菌的包涵体可通过离心收获。为防止破碎后的细胞碎片与所要收集的包涵体通过离心难以分离, 细菌裂解过程必须充分。分离出来的包涵体主要由重组蛋白组成, 同时也含有一些外膜蛋白 (Omp C、Omp F、Omp A) 、16S和23S的r RNA、质粒DNA和其他杂质。去除这些杂质, 可用去垢剂Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂等充分洗涤包涵体。包涵体洗涤的洁净程度, 对于后续的纯化步骤十分重要, 包涵体纯度高, 可以大大降低后续的纯化压力。但是, 变性剂尿素的使用应注意大肠杆菌外膜蛋白Omp T (37k D) 在4~8 mol/L的尿素中具有蛋白水解酶活性, 在包涵体的溶解和复性过程中会引起蛋白质的降解。

　　3 包涵体的溶解

　　包涵体蛋白溶解需要的变性剂 (尿素, 盐酸胍等) 、去污剂 (NLS、CTAB、SDS) 和还原剂 (琉基乙醇、半耽氧酸、二硫苏糖醇等) 可破坏蛋白质的高级结构和肽链之间的疏水键, 从而使蛋白质肽链相互分离。包涵体的溶解和复性是相互联系的, 其溶解条件与复性条件的效率相辅相成。由于包涵体是部分折叠蛋白质聚集而成的具有天然或天然样构象的二级结构, 在适宜的条件下将其溶解变性, 这些天然样构象的二级结构将不被破坏而保留, 更利于复性工艺中的蛋白质回收。部分学者认为, 高浓度的变性剂 (盐酸胍等) 能够完全破坏掉蛋白质的天然结构。因此, 要保留天然的二级结构必须采用温和的溶解方法。例如, 应用低浓度的尿素对包涵体进行温和处理, 可保留目标蛋白的部分二级结构。此外, 一些表面活性剂也可以溶解包涵体而不破坏二级结构。但保留部分二级结构可能因为引入的外来物质引起蛋白质化学键的错配, 从而导致后续复性效率下降。含有半胱氨酸的蛋白其包涵体中常常包含一些链间二硫键和无活性的链内二硫键, 应加入巯基还原剂 (DTT、GSH或β-ME等) 进行处理以还原这些二硫键。螯合剂 (EDTA、EGTA) 可捕获金属离子, 以防止金属离子氧化反应的发生。

　　4 纯化

　　这里的纯化指变性蛋白的纯化, 其目的在于去除杂蛋白, 保留目的蛋白, 同时可提高后续复性效率, 也可在纯化过程中直接进行柱上复性。但工业生产中常常通过稀释复性, 这种方法便于操作, 且成本较低, 较其他复性方法具有很大优势。其缺点是复性后溶液体积较大, 溶液组分复杂。因此, 在上一工艺步骤需要充分考虑蛋白浓缩和纯化条件的选择, 如在重组构建的过程中, 加入亲和标签就可采用离子交换介质或亲和层析等方法快速地捕获目的蛋白, 从而起到纯化的作用。

　　目前常用的亲和性标签有六聚组氨酸 (6-His tag) 和谷胱甘肽 (GST) 等。利用镍离子与6-His tag的亲和性, 通过在蛋白质的N端或端加上6~10个组氨酸标签, 在变性条件下借助其能够被镍离子螯合柱捕获的特征, 用咪唑洗脱或将p H降到5.9使组氨酸充分质子化, 与镍离子脱离, 从而将带有6-His tag的目的蛋白质纯化出来。

　　蔡中华等应用此方法对虹鳟肿瘤坏死因子 (TNFα) 重组蛋白进行纯化。经镍亲和层析柱后, 获得了高纯度的重组TNF蛋白。通过检测纯化蛋白含量, 每升细菌可获得0.5~1 mg重组蛋白。通过镍亲和树脂分离纯化, 可获得高纯度的重组人胰蛋白酶原。有报道称, 包涵体经过反复洗涤和镍离子柱亲和层析纯化后, 获得的重组GST-TRX融合蛋白纯度较高, 经SDS-PAGE电泳分析, 只可见一条重组融蛋白条带。将大肠杆菌表达的v MIP-Ⅱ包涵体变性溶解后, 用镍亲和柱层析纯化, 得到的目的蛋白纯度可达到90%以上。蛋白质的纯化是一个具有挑战性的任务, 对蛋白空间结构和构象的理解, 使得攻克复杂蛋白的复性工艺研究得以实现。

　　5 复性

　　复性是指在氧化还原的条件下, 去除溶液中的变性剂, 使得无活性蛋白质恢复活性, 重新获得空间构象的过程。蛋白质纯化后, 经过还原剂处理的多肽链处于还原状态。为使外源表达蛋白获得正确的二硫键及天然构象, 需要将溶液中混有的变性剂和还原剂去除, 常用透析法、凝胶过滤法和稀释法使变性的蛋白质恢复活性。透析法改变蛋白质分子周围溶剂的性质, 促进二硫键重新组合, 此过程的操作较复杂。稀释法是通过降低变性剂浓度, 使蛋白质折叠接近平衡, 此方法在工业生产中的应用比较广泛。复性效率的高低通常由许多条件共同决定, 包括包涵体溶解条件、溶剂组分、蛋白浓度、复性温度、复性p H值、离子强度、溶液混合程度等因素。

　　复性后的肽链在疏水作用下快速形成具有天然结构的中间体, 中间体通过调整局部结构形成天然蛋白质的三级结构。在中间体表面暴露的疏水残基和自由琉基, 在分子间疏水相互作用下容易聚集形成沉淀。变性蛋白复性过程要经过折叠过程, 完全变性状态下的蛋白质存在多肽链与变性剂之间的相互作用, 肽链内部或肽链与水分子的作用容易被变性剂取代。变性剂浓度降低后, 其作用力逐渐降低。对于具有二硫键的重组蛋白, 复性时需要考虑二硫键的正确配对。空气中氧气的氧化作用可以使还原型半胧氨酸残基形成二硫键。复性的重组蛋白暴露在空气中, 可保证复性过程顺利进行, 其缺点是整个过程的氧化速度难以控制。不同结构的蛋白质复性过程存在差异, 缓冲液的组成、复性的温度、溶液p H、蛋白质浓度等都会影响对蛋白质的特性和分子结构。

　　6 讨论

　　疫苗接种是预防控制FMD的重要举措, 评价一种疫苗的好坏需要从安全性、效力、生产成本与工艺、使用简便等方面进行衡量。传统疫苗在这些方面均存在一定的不足, 新型疫苗因在生物安全方面的优势已经远超过传统疫苗, 基因工程技术的发展为新型疫苗的研发提供了新的思路, 目前正在研发的新型疫苗有很多种, 本文介绍的都是近几年研究较多且具有一定应用前景的新型疫苗。新型疫苗相比灭活疫苗在安全性上更有优势, 可根据需要制备同一病毒多个成分或多价病毒疫苗, 具有大幅度降低生产成本等优点, 是未来的发展方向。但新型疫苗的免疫效果不够理想, 普遍存在抗原位点少、抗原反应性弱、抗原分子量小等问题, 不能诱导较强的免疫应答。

　　本文所阐述的内容为表位蛋白疫苗, 以大肠杆菌为载体进行蛋白表达的工艺研发虽然技术成熟, 但由于表达产物不同, 所需要的工艺研发存在很大差异。特别是FMD基因工程疫苗作为一种新型FMD疫苗投入生产, 还需要解决很多的工艺问题。由于疫苗工艺研究涉及到企业的核心技术, 资源相对保密, 无法共享, 这也是阻碍FMD基因工程疫苗发展的原因之一。因此, 应将现有的FMD灭活疫苗的工艺程序与报道的其他基因工程疫苗的工艺程序相结合, 更加广泛、深入的研究FMD基因工程菌与各个培养因素之间的关系, 制定出一套适合本菌株增殖、表达、纯化的方案, 打破传统的生产模式, 为FMD疫苗的生产提供另一种生产方法与思路, 同时也为我国FMD的防治与预防提供另一种新的途径与希望。