盐藻细胞DsRab蛋白的诱导表达及纯化

　　盐生杜氏藻（Dunaliella salina，以下简称盐藻）的细胞结构简单，具有很强的抗盐能力，可以生长在 5.0 mol/L NaCl 培养液中，而且其培养条件也很简单。因此，盐藻是研究植物耐盐分子机制的重要模式生物。研究表明当盐藻在高盐环境胁迫下，体内的蛋白质合成和降解以及能量代谢等多种代谢途径会发生很大程度的改变，其中耐盐作用主要是依靠盐藻中 Na+/H+泵和大量合成兼容性溶质甘油，但应答盐胁迫的调控过程还少有报道。从信号传导方面开展对盐藻抗盐生理调节过程的研究，有助于全面了解盐藻耐盐机制。

　　小 G 蛋白（Small GTP-binding proteins）分子量一般在 20-30 kD 之间，以单体形式普遍存在于真核生物中，通过激活态（结合 GTP）与非激活态（结合 GDP）的转变来行使分子开关作用，参与重要的细胞生理活动，包括信号传导、细胞增殖、囊泡转运、细胞骨架重组等。Rab 蛋白是小 G 蛋白家族（Ras、Rho、Rab、Arf/Sar 和 Ran 5 个亚家族）中最大的亚家族，近年来在酵母、果蝇、拟南芥、烟草、水稻等真核生物中发现的 Rab 蛋白遍布于胞内的各个膜区室，在胞吞和胞吐作用中，不同的Rab 蛋白定位于特定的细胞器膜上，参与膜泡的形成、定向转运、锚定链接等过程。现已发现许多与植物的抗逆性有关的 Rab 蛋白，其表达量会受到盐胁迫、低温、干旱等逆境条件的影响。因此，深入了解 Rab 蛋白功能及进一步研究植物抗逆性相关蛋白的相互作用网络具有重要科学意义。

　　本实验室已从盐藻细胞中成功克隆出新的 Rab蛋白基因DsRab（GenBank Accession No.JN989548），并用实时荧光定量 PCR 方法研究了DsRab基因在盐胁迫下的表达情况，证明DsRab是一个盐诱导上调基因。本试验构建重组表达载体 pGS-21a-DsRab，通过优化诱导表达条件使 DsRab 蛋白在上清中的表达量增加，利用 GST-SefinoseTMKit 纯化，获得纯度较高的可溶性融合蛋白，为制备抗体以及进一步在蛋白质水平上研究该蛋白在盐藻耐盐性机制中的作用奠定基础。

　　1、材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌种和质粒 大肠杆菌（E.coli）菌株 DH5α、E.coliBL21（DE3）、 质粒 pGS-21a 由本室保存；pMD18-T Simple Vector 购自 TaKaRa 公司。

　　1.1.2 试剂 限制性内切酶、Taq酶、IPTG、X-gal、T4 连接酶购自 TaKaRa，硝酸纤维素膜、Anti-GSTAntibody、HRP-IgG、沉淀型单组分 TMB 底物溶液购自 TIANGEN，GST-SefinoseTMKit（BSP032-7），Pr-estained Protein Molecular Weight Marker 购自生工生物工程（上海）有限公司，凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 原核表达载体的构建 根据DsRab基因 cDNA全长序列（GenBank Accession No.JN989548）设计引物并加入酶切位点，上游引物（含EcoR I 酶切位点）P1 ：5'-CGGAATTCATGAACCCAGAGTACGACTACC-3'，下游引物（含 SalI 酶切位点）P2 ：5'-GTCGA-CCTAGCAGCAGGTGGAGCGG-3'。以总 RNA 反转录的 cDNA 为模板，P1，P2 为引物进行 PCR 扩增。扩增条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 个 循环 ；72℃延伸9 min。扩增产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，回收目的片段，连接到 pMD18-T simple 载体上（T-A克隆），构建重组质粒 pMD18-DsRab，转化 E.coliDH5α 感受态，在 Amp 抗性平板上筛选阳性单克隆。用EcoR I、SalI 双酶切目的片段和 pGS-21a 质粒，用 T4 连接酶连接，构建表达载体 pGS-21a-DsRab，转化E.coliDH5α 感受态，筛选阳性单克隆，交由大连宝生物公司测序，以验证读码框的正确性。

　　1.2.2 融合蛋白的原核表达 将测序鉴定正确的表达质粒 pGS-21a-DsRab 转化 E.coliBL21（DE3），挑取阳性单克隆，接种于 5 mL 含氨苄青霉素（50mg/L）的 LB 液体培养基中，37℃过夜培养。次日，按 1% 的比例接种到 5 mL 新的 LB 液体培养基（氨苄青霉素 50 mg/L）中，37℃振荡培养到菌液OD600=0.6-0.8 时，试验组加入终浓度为 1 mmol/L 的IPTG，对照组不加 IPTG，37℃诱导 6 h。离心收集菌体，用 0.01 mol/L PBS 缓冲液悬浮，冰上超声波破碎，4℃、12 000 r/min 离心 10 min，分离上清与沉淀，加上样缓冲液，对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 检测。

　　1.2.3 融合蛋白表达条件的优化 按 1.2.2 相同方式过夜培养的菌液，1% 的比例转接到新的 LB 液体培养基（氨苄青霉素 50 mg/L）中，37℃振荡培养到菌液 OD600=0.6-0.8 时，进行分组培养 ：IPTG 终浓度梯度为 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.0 mmol/L ；诱导温度梯度为 25、28、30、35 和 37℃ ；培养 6 h。离心收集细菌，0.01 mol/L PBS 缓冲液悬浮，冰上超声波破碎，离心取上清，用 SDS-PAGE 检测。

　　1.2.4 重组蛋白的纯化 优化表达条件下，将过夜培养的菌液按 1% 的比例接种于 100 mL 的 LB 液体培养基（含氨苄青霉素 50 mg/L）中，37℃振荡培养至菌液 OD600=0.6-0.8，加入终浓度为 0.1 mmol/LIPTG 诱导表达，28℃振荡培养 6 h。4℃、8 000 r/min离心 3 min，收集细菌，用 20 mL 0.01 mol/L PBS 缓冲液悬浮，冰上超声波破碎，4℃、12 000 r/min 离心 20 min，取上清并用 0.45 μm 滤膜抽滤。用 GST-SefinoseTMKit 纯化，SDS-PAGE 电泳检测。

　　1.2.5 Western blotting 检测 纯化后的融合蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，电转移至 NC 膜（200 mA，2h），用 5% 牛血清白蛋白 4℃封闭过夜，加入一抗Anti-GST Antibody（1∶2 000），37℃孵育 1 h，0.01mmol/L PBST 洗涤 3 次，每次 5 min，然后加入二抗 HRP-IgG（1∶200），37℃ 孵 育 1 h，0.01 mmol/LPBST 洗涤 3 次，每次 5 min，然后加入沉淀型单组分 TMB 底物溶液显色。

　　2、结果

　　2.1 原核表达载体的构建

　　经 PCR 扩增获得一条 600 bp 左右的条带（图1-A），与预期片段大小一致。EcoR I、SalI 双酶切重组质粒 pGS-21a-DsRab，结果（图 1-B）表明目的片段已与 pGS-21a 质粒正确连接，重组质粒可以用于测序。测序结果表明扩增片段与DsRab基因开放阅读框完全一致，读码框正确，原核表达载体 pGS-21a-DsRab 构建成功。

　　2.2 融合蛋白的原核表达

　　对照组表达菌（含有空载体 pGS-21a）诱导后，在 35 kD 左右有一条表达增强的标签蛋白条带，含有重组质粒的表达菌诱导后在 57 kD 左右有一条明显表达增强的条带，此条带在对照组没有出现，与预期结果相符（融合蛋白包括预计分子量为 22 kD的 DsRab 蛋白和 35 kD 的标签蛋白）（图 2-A）。结果还显示，上清和沉淀均可见清晰的目的蛋白条带，表明目的蛋白为部分可溶性表达。

　　2.3 融合蛋白表达条件的优化

　　电泳结果显示，诱导剂 IPTG 的浓度在 0.1-1.0mmol/L 范围内，融合蛋白的表达量没有太大变化（图2-B）。在 25、28、30、35 和 37℃ 5 个诱导温度下，融合蛋白的表达量比较，在 28℃诱导时，融合蛋白的表达量最大（图 2-C）。在最优条件下，融合蛋白的可溶性表达量显著增加（图 2-D）。

　　2.4 重组蛋白的纯化及鉴定纯化产物经 SDS-PAGE 检测，在 57 kD 左右有单一蛋白条带，表明融合蛋白被有效纯化（图 3-A）。Western blotting 检测（图 3-B）显示，融合蛋白能与抗 GST 单克隆抗体特异性结合，具有良好的免疫学活性，表明融合蛋白在E.coliBL21（DE3）中成功表达。

　　3、讨论

　　高盐环境下，植物对盐胁迫的应答是非常复杂的过程，涉及一系列与抗逆性相关的信号传导过程。研究表明 Rab 蛋白作为一种分子开关蛋白，分布于胞内所有的亚细胞结构，不同的 Rab 蛋白与相应的上游调控因子和下游效应因子相互作用，参与了胞内几乎所有的膜运输过程。近来大量研究报道证实有些 Rab 蛋白与植物的高盐适应性有关。

　　Mazel 等将拟南芥AtRab7在转基因植物中表达，加速了转基因植物根、叶和原生质体中的胞吞作用，对盐和渗透胁迫的耐受性提高。O’Mahony 等在牧草（Sporobolus stapfianus）中发现的 sRab2 可能涉及由植物 ABA 参与的耐旱信号的传导。水稻在冷冻、干旱及生长激素 ABA 存在的条件下，OsRab7基因的 mRNA 含量呈现不同的趋势；高盐胁迫下，普通冰草Rab5B、烟草PgRab7、花生AhRab7基因的表达量都有增加。

　　在高度耐盐的模式生物盐藻中，有关 DsRab 蛋白的研究鲜有报道。本实验室已经克隆得到盐藻新基因DsRab，并初步证明该基因与盐藻耐盐性有关，为进一步研究 DsRab 蛋白在盐藻抗盐应答中的作用，获得高纯度的可溶性的 DsRab 蛋白是非常重要的。

　　本试验中融合蛋白的表达选用经典的大肠杆菌原核表达系统，表达的融合蛋白在细胞的上清和沉淀中均有存在，说明融合蛋白以可溶性及包涵体形式表达。为了获得大量的可溶性蛋白，对诱导剂浓度和诱导温度两个表达条件进行了优化。其中诱导剂IPTG 在 0.1-1.0 mmol/L 范围内，融合蛋白表达量相差不大，为尽可能减少包涵体形式的蛋白表达，诱导剂的浓度越小越好。试验中的 5 个诱导温度比较，28℃时蛋白的表达量最大。所以确定的最优表达条件是 0.1 mmol/L IPTG，28℃，诱导培养 6 h。

　　本试验中纯化的可溶性 DsRab 蛋白可以用于筛选与该蛋白可能发生相互作用的蛋白质，进一步了解 DsRab 上下游的作用因子。为深入研究盐藻DsRab 蛋白在抗盐方面的作用，也可以在转基因的植物中过量表达该蛋白，检测转基因植物的高盐适应性。这些结果，不仅为下一步制备抗体并进一步研究 DsRab 蛋白在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础，而且为该类蛋白在植物抗逆中的作用提供了新的信息。

　　4、结论

　　成功的构建了盐藻 DsRab 蛋白的原核表达载体pGS-21a-DsRab，并在大肠杆菌 E.coliBL21（DE3）表达体系中成功表达，优化诱导表达条件后，纯化上清蛋白，获得了纯度较高的可溶性融合蛋白。Western blot 初步证明该融合蛋白就是带有 GST 标签的 DsRab 蛋白。

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