探讨限制手工克隆的因子及对哺乳动物体细胞核移植技术的优化

克隆技术论文第三篇：探讨限制手工克隆的因子及对哺乳动物体细胞核移植技术的优化

　　摘要：哺乳动物体细胞核移植技术 （Somatic Cell nuclear transfer, SCNT） 近几十年的发展取得了巨大的成就， 但由于需要繁琐的技术、昂贵的显微操作仪且核移植效率不理想， 阻碍了核移植克隆的规模化发展。近年来科学界运用了新的革新方法-体细胞手工克隆 （Handmade Somatic Cell Cloning, HCM） , 其操作无需显微操作仪， 对操作人的技术要求不高， 是纯手工核移植技术。该技术不仅简化操作程序， 还提高核移植效率， 对今后哺乳动物核移植研究有重要的推动作用。该综述将从核移植技术的研究与进展方面， 探讨限制手工克隆 （HCM） 的因子并以此来优化手工克隆技术。
　　关键词：卵母细胞；手工克隆；去透明带；核移植；

　　作者简介：王巨龙 （1988-） , 男， 安徽宿州人， 助教， 从事动物繁殖和遗传育种工作。；

　　Abstract:Mammalian somatic cell nuclear transfer has achieved great accomplishments through the past few decades' development.However, the limitations of industrialization of nuclear transfer are cumbersome technology aswell as expensive equipments and unsatisfied with the efficiency of nuclear transfer.In recent years scientists applieda novel somatic cell cloning method, which called handmade somatic cell cloning （HCM） .Zona-free procedure mayoffer a solution for the latter problem.It is unnecessary micromanipulation for handmade somatic cell cloning andworkers don' t require many skills.This technology is not only simplified the operation but also improved the efficiency of somatic cell nuclear transfer, which will advance the development and the industrialization of nuclear transferto improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer in future.This review will from the research progresses onHMC to explore the effects of handmade cloning factors and in order to optimize the handmade cloning technology.

　　Keyword:Oocyte; Handmade cloning; Zona-free oocytes; Nuclear transfer;

　　自Briggs and King （1952） [1]等人手工操作成功地将两栖类美洲豹蛙 （leopard frog） 卵母细胞去核以来， 科研者不断地完善哺乳动物的核移植技术。1997年， 英国《自然》期刊报道了Wilmut等[2]利用绵羊乳腺细胞进行核移植实验， 首次获得世界上第一只克隆绵羊Dolly.这一开创性的实验证实哺乳动物体细胞具有全能性， 为后续开展的体细胞核移植提供理论基础。在此之后科学家利用哺乳动物体细胞核移植技术先后成功克隆出猪[3]、牛[4]、兔[5]、小鼠[6]、马[7]等多种哺乳动物， 其中在2017年我国科学家首次成功完成克隆猴-"中中"和"华华".然而核移植克隆的后代表现出体弱， 生存力不强易致病死亡甚至出现衰老迹象[8,9]等特征， 这些原因还有待进一步研究。Vajta等[10]认为传统的核移植技术存在着种种缺陷， 无法满足克隆技术向规模化发展， 其原因为： （1） 核移植效率低； （2） 需要昂贵的设备以及熟练的技术操作 （3） 移植后妊娠率低， 出生后死亡率高。1964年Gwatkin.R发现小鼠囊胚的透明带暴露于酸性溶液时可以被溶解。研究学者开始尝试用无透明带卵母细胞受精进行囊胚发育， 研究表明透明带并非胚胎发育所必需的。Peura等[11]首次研究报道， 牛的克隆成功应用去核卵且无透明带的卵母细胞与2-cell卵裂球融合。同时微穴法 （well of the well, WOW） [11]发展完备培养系统为无透明带的重构胚单个培养提供可能。Vajta等[10]改进Peura方法不依靠显微设备， 首次以体细胞为供体， 将无透明带核移植技术成功应用于克隆牛。这一革新的核移植技术便是手工克隆技术 （Handmade Somatic Cell Cloning, HCM） , 利用这项技术已经成功得到了牛[10]、小鼠[13]、猪[14]、马[15]、绵羊[16]等哺乳动物核移植后代。此后， 科研人员不断完善手工克隆技术， 使核移植效率提高， 操作程序更简化， 实验耗资少， 使大规模开展哺乳动物核移植研究成为可能。本文着重从手工克隆技术操作， 以及限制手工克隆成功因子等方面进行论述， 以期进一步优化手工克隆技术。

　　1 手工切割卵母细胞去核

　　1.1 卵母细胞去透明带

　　将获取得到的未成熟的卵母细胞体外培养成熟 （IVM） , 以卵母细胞排出第一极体为成熟标志。然后用移液枪反复吹打成熟卵母细胞吹散粘连的颗粒细胞。选取外膜完整胞质充满成熟的卵母细胞移入链酶蛋白酶 （Pronase E） 微滴中。去透明带一般需要5~10min左右， 当观察到大多数卵母细胞开始变形时迅速转至T20 （20%胎牛血清的TCM-199基础液） 清洗终止消化， 最后将无透明带的卵母细胞移至细胞松弛素 （Cytochalasin B, CB） 微滴中， 然后放置37℃、5%CO2恒温培养箱孵育20min.Vajta[17]等将成熟的牛卵母细胞用CB 2.5ug/ml+T20处理后并在特定的位置切割细胞， 其后期胚胎正常发育率高达90%以上。

　　1.2 卵母细胞去核

　　卵母细胞去核方法有多种， 主要有盲吸去核法、DNA染色荧光去核法、化学药物诱导去核法等， 但大部分都要借助显微操作仪才能完成去核。杜卫华等研究利用药物诱导小鼠卵母细胞的化学去核， 其去核率与盲吸法去核无显著差异。Peura等采用手工切割卵母细胞与Hoechst33342荧光染色去核技术相结合可获得90%的去核率。Westhusin等实验表明Hoechst33342染色和紫外线 （UV） 短时间照射不会影响体细胞在去核卵母细胞发育的全能性。此后实验室手工克隆基本采用westhusin方法。将自制的特殊的切割刀片[18]或玻璃针小心将固定的卵母细胞切割两半， 也可以将切割工具安装在显微操作臂上， 通过显微操作仪将卵母细胞切割去核。卵母细胞恢复后使用Hoechst33342进行DNA染色， 通过显微镜的紫外光线短暂照射将含有细胞核的卵细胞去除， 无核的胞质卵保留。

　　2 供体细胞核来源

　　供体细胞核来源可以从胚胎发育过程的各个阶段获取如原核受精卵、胚胎的卵裂球 （ES细胞） 、胎儿细胞、分化成熟的体细胞等。近年的实验表明， 作供体细胞重构胚的早期的ES细胞要优于成纤维细胞构建的重组胚发育潜力。这进一步揭示， 供体细胞的来源其细胞核分化的程度越低， 构建的重构胚发育潜力越高。当前研究认为核移植的成功率低， 大多归因于未能完全再程序化供体细胞中的后成性基因印记[19], 因此， 为提高核移植成功率， 均注重供体细胞来源的选择。另有研究发现， 供体动物的年龄、供体细胞的类型、供体细胞周期、体外培养传代次数等诸多因素， 均可能影响核移植的效率， 但在HCM克隆方面还没有系统研究。

　　3 重构胚的融合/激活

　　卵母细胞的融合与激活是手工克隆技术关键的一步， 电融合被广泛的用于供体细胞核融合到受体胞质中。它是将无核的胞质卵与供体体细胞通过电融合的方法， 分为一次融合法和二次融合法。

　　3.1 供体一半卵一半卵一次电融合法

　　一次融合指通过电融合同时将两枚无核的半卵和一枚供核体细胞粘连在一起， 其排列顺序为：无核半卵一无核半卵-供体细胞。其具体做法：将低密度的供体细胞悬浮液先移入植物凝集素 （500ug/m L PHA） 操作液中， 再将无核的半卵移入， 进行无核半卵一无核半卵-供体细胞粘和， 然后进行电融合， 在稳定电压自动排序。谭世俭等在牛的重构胚融合， 融合效率达到 （95.68±3.97%） [20].

　　3.2 半卵-供体-半卵二次电融合法

　　两次融合指一枚无核半卵先与供体细胞融合， 融合后的半卵再与另一枚无核半卵进行融合。根据Vajta等研究报道， 经过两次融合， 其重构胚的融合效率达到76%.

　　3.3 重构胚的激活

　　当精子进入卵母细胞过程中， 诱导卵母细胞某些化学变化而使其处于激活的状态。激活后的卵母细胞开始胚胎发育， HCM胚胎发育也需要像精子激活卵母细胞一样发育。2001年Vajita等人， 通过电脉冲进行HMC胚胎的激活。目前激活的方法主要有化学激活和电激活， 研究者常用乙醇作为HCM胚胎的激活剂， 将融合后的卵母细胞置于7%乙醇的微滴中培养60~90min以此来激活HMC胚胎。罗光彬等采用8%乙醇处理卵母细胞10min, CB+6-DAMP处理7h, 卵裂率为40%左右。Kragh等[21]利用HMC技术使用化学激活和电激活相结合的方法进行猪的体细胞核移植时， 激活率为 （49±1） %.

　　4 HCM重构胚的培养

　　激活后无透明带卵母细胞培养条件不同于传统的胚胎培养方法。它要求培养的条件要相对独立， 避免胚胎间相互粘连， 因此无透明带核移植重构胚需要单卵培养。研究者使用共培养或加入有利胚胎发育的生长因子的方法来进行独立培养， 然而其发育效果要低于群卵培养。许多培养基用于哺乳动物胚胎的培养， 例如小鼠的胚胎可在Whitten培养基培养， Brachett and Oliphant等以BO培养基作为兔子胚胎的培养液。合成输卵管液 （The synthetic oviduct fluid medium, m SOF） 被广泛的用于牛胚胎的培养。

　　4.1 WOW培养系统

　　WOW培养系统 （The well of the well （WOW） system） 是在Vajta研究的基础上进行改进。将毛细玻璃管顶端灼烧制成小圆玻璃球 （直径约为0.5~1mm） , 微热时立即压入细胞培养皿底部， 利用余热可在培养皿底部形成500μm以上圆形微孔。利用WOW系统培养法， Taka等[22]分别采用了内径为500μm和1000μm的圆形微孔培养单精注射的猪受精卵， 结果发现内径为1000μm的WOW有较高的囊胚率 （24.6%） .

　　4.2 微囊培养法

　　根据Adinaya等[23]报道进行改进， 其制作方法：在10#的注射器内， 将胚胎和海藻酸钠溶液混合， 通过推动活塞将混合的胚胎从针头流出时， 液滴被同方向的气体吹落至含氯化钡溶液中， 发生交联反应而形成凝胶， 该方法制作的微囊直径大约是0.5~10mm.Cosby等将无透明带胚胎用海藻酸钠包裹以微囊培养法培养， 无透明带胚胎囊胚发育率低于完整透明带胚胎的囊胚发育率。

　　5 限制HCM操作成功的因子

　　5.1 不同哺乳动物最适Pronase E浓度

　　去除卵母细胞透明带的方法有许多种， 现阶段主要用酸性台氏液法与链酶蛋白 （Pronase E） 法。高源等报道， 发现去除透明带使用酸性台氏液法和0.5%链酶蛋白酶法对小鼠早期胚胎处理两者没有差异。目前HCM操作使用的主要是链酶蛋白酶法， 猪的去除透明带Pronase E浓度是在3.3mg/ml[24].Vajta等[25,26]以浓度为1.5~2.0mg/ml Pronase E应用在牛上。

　　5.2 供体细胞与受体卵母细胞的细胞周期的同步

　　核移植中无核的受体卵母细胞胞质内储存大量的能量、m RNA及各种生长因子， 这些物质为早期胚胎发育提供了一切必需的原料。目前哺乳动物体细胞克隆的受体胞质是MⅡ期卵母细胞。特别是供体核进入母体胞质关键期， 胚胎发育完全依赖母源性物质， 因此受体胞质质量决定着胚胎发育， 然而核移植操作过程中胞质的溶液损失又是很难克服的。有研究报道发现， 受体卵母细胞胞质的过多或过少， 都会影响核移植重组胚的囊胚细胞数及其体外发育率。因此手工克隆切割细胞时要求尽量减少受体胞液外流。供体细胞同步化是无血清培养液处于G0/G1期细胞作为供体细胞核。Renard等研究表明， 经过"饥饿"处理的胎儿成纤维细胞能够获得高的克隆成功率。

　　5.3去透明带胚胎的问题

　　透明带 （zona pelluccida, ZP） 是一层包绕在所有哺乳动物卵母细胞外围的非细胞糖蛋白结构， 对卵子的发育、受精以及着床前胚胎发育起着关键性作用。正常发育的早期胚胎都有透明带， 在体内透明带可抵御细菌， 白细胞或免疫学攻击， 在体外它可以抵御培养基内的有毒物质及细菌。有研究报道指出， 在胚胎体外培养条件下， 透明带不是胚胎发育至关重要的。HCM去透明带胚胎可能会受到培养基内有害物质的影响， 胚胎的发育受到阻滞。Elsheikhet等通过人工构建透明带来解决这些问题。

　　总之， 手工克隆较传统核移植克隆技术操作程序要简单， 不需要昂贵的操作仪器， 对克隆感兴趣的任何人都可以在简单的实验室内操作完成。目前HCM方法获得克隆动物还不多， 但已经在具有经济价值动物类克隆上取得了成就， 猪、绵羊以及小鼠已先后用HCM克隆出。相信在未来将有更好的HCM克隆程序被应用于具有优良基因的动物繁殖， 挽救濒危动物， 以及开发具有医药价值的转基因动物培育。因此哺乳动物HCM克隆将会在未来商业化规模化进程中发挥重要的作用。

　　参考文献

　　[1]Briggs R, King TJ.Transplantation of living cell nuclei from blastula cells into enucleated frog egg[J].Proc .Natl Acad Sci, 1952 （38） :455-463.

　　[2]1.Wilmut, A.E Schnieke, J.Mc Whir, et al Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cell[J.Nature, 1997 （385） :810-813.

　　[3]Polejaeva IA, Chen SH, Vaught TD, et al.Cloned Pigs Produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nature, 2000 （407） :86-90.

　　[4]Robl JM, Prather R, Barnes F, et al Nuclear transplantation in bovine embryos[J] Anil Sci, 1987 （64） :642-647.

　　[5]Patrick Chesne1, Pierre G. Adenot1, et al Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nature Biotechnology.2002, 20（4） :366-369.

　　[6]Kono T, Tsunoda Y.Nuclear transplantation in rat embryos[J]. Ex P Zool.1988, 284:303-305.

　　[7]Cesare Gali, lrina Lagutina, Gabriella Crotti, et al Pregnancy:A cloned horse born to its dam twin[J]. Nature, 2003, 424 （6949） :635.

　　[8]Hill, Cibelli, Roussel, et al Clinical and pathologic features of cloned transgenic calves and fetuses （13 case studies） [J].Therio, 1999 （51） :1451-1465.

　　[9]Cibelli J B, Campbell K H, Seidel G E, et al.The healt profile of cloned animals[J].Nature Biotech, 2002 （20） :13-14.

　　[10]Vajta, lan M, Poul H, et al Somatic cell cloning without micromanipulators cloning[J]. Cloning, 2001 （3） :89-95.

　　[11]Peura TT, Lewis 1.M, Trounson A.O.The effect of recipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle[J].Mol Reproduce Dev, 1988 （50） :185-191.

　　[12]Vajta G, Peura TT, Holm P, et al.New method for culture of zona-icluded or zona-free embryos.the Well of the Well （WOW） system[J].Mol Reproduce Dev, 2000 （55） :256-264.

　　[13]Ribas R, Oback B, Ritchie W, et al. Development of a zonafree method of nuclear transfer in the mouse[J.Cloning Stem Cells, 2005 （7） :126-1

　　[14]Du Y, Zhang Y, LiJ et al.Piglets born from handmade cloning[J].Reproduce Fertile, 2007, 19: 135.

　　[15]Lagutina I, Lazzari G, Duchi R, et al. Somatic cell nuclear transfer in horse,;ffect of oocyte morphology, embryo reconstruction of method and donor cell type[J]. Reproduction, 2005 （4） :559-567.

　　[16]Lagutina I, Lazzari G, Duchi R, et al.Comparative aspects of Somatic cell nuclear transfer with conventional and zona-free method in cattle, horse, pig and sheep[J].Theriogenology, 2007 （1） :90-98.

　　[17]Vajta, lan M Alan O, et al.Handmade Somatic Cll Cloning:in Vitro[J] Biology of Reprod, 2003 （68） :571-578.

　　[18]黄章虎，任艳萍，谭世俭等徒手克隆工具的自制及改进[J].中国畜牧兽医，2011 （5） :237-240.

　　[19]Rideout W M, Eggan K, Jaenisch R. Nuclear cloning and epi-genetic reprogramming of the genome[J] Science, 2001 （293） :1093-1098.

　　[20]谭世俭， Qion L M,石德顺牛去透明带卵体细胞核移植技术的应用研究[J].广西农业生物科学， 2003 （3） :201-206.

　　[21]Kragh PM, Du Y, Corydon TJ, et al Efficient in vitro produc tion of porcine blastocysts by handmade cloning with a com- bined electrical and chemical activation[J].Theriogenology, 2007 （1） :90-98.

　　[22]Ta Ka M, Iwayama H, Fukui Y, et al.Effect of the well of thewel （IWOW） system on in vitro culture for porine embryos afterintracytoplasmic sperm injection[J].Journal of Reproduction andDevelopment, 2005 （51） :533-537.

　　[23]Adinaya G.K, Rawlins RJ, Miller IF, et al.Efect of sodium algi-nate encapsulation on the development of preimplantation mouseembryos[J]InVitro Fertil Embryo Transfer, 1987 （4） :343-345.

　　[24]王献伟，韩露，等猪手。 I克隆胚胎生产程序[J]黑龙江畜牧兽医，2014 （6） :69-71.

　　[25]Vajta, lan M, R.Tayfur. Tecirlioglu.Handmade Somatic Cell Clon-ing in Cattle[J]. Methods in molecular biology, 2006 （68） :571-578.

　　[26]Vajta, lan M, Alan 0, et al.Handmade Somatic Cell Cloning inCattle:Analysis of Factors Contributing to High Efficiency inVitro[J] Biology of rep .roduction, 2003 （68） :571-578.