GP73蛋白基因的克隆与表达纯化

　　前言

　　高尔基体糖蛋白 -73（GolgiProtein73, GP73）又称Ⅱ型高尔基体膜蛋白 (Golgi phosphoprotein2,GOLPH2) 和高尔基体膜蛋白1（Golgi membrane pro-tein1, GOLM1），因其相对分子质量为7.3×104而命名为 GP73。新近的研究发现 GP73与肝脏疾病、尤其与肝癌密切相关，有望成为继 AFP 后灵敏度、特异性更高的肝癌血清学标志物。但作为新的标志物，GP73需要更广泛的实验室及临床对照试验加以验证。为进一步探讨 GP73与肝癌的关系，及其在肝癌诊治中的作用，本研究从肝癌细胞系中克隆 GP73基因，表达及纯化 GP73蛋白，旨在为后续研究提供基础。

　　1、材料与方法

　　1.1材料来源　原核表达载体 pET-21a(+)-TRX 由本实验室在 pET-21a(+) 的基础上改建而成、肿瘤细胞系 HepG2、大肠杆菌 DH5α、感受态 BL21（由本实验室保存）；RNA 抽提试剂盒、DNA 聚合酶、RT-PCR 试剂盒、蛋白 Marker、T4DNA 连接酶、质粒抽提试剂盒（Ferments 公司）；His-tag 磁珠纯化试剂盒（日本Toyobo 公司）。

　　1.2目的基因的扩增　HepG2细胞常规培养至对数生长期，抽提总 RNA，以此为模板，RT-PCR 扩增 GP73基因的全长序列，根据 pET-21a(+)-TRX 及GP73的序列，设计克隆引物：5'-CGCGGATCCGATGATGGGCTTGGGAAACGG-3'，3'端引物如下：5'-CCCAAGCTTGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACG-3'。在5' 端和3' 端引物分别引入 BamH Ⅰ酶切位点和 Hind Ⅲ酶切位点。PCR 扩增条件：95℃1min，60℃30s，68℃1min30s，35个循环后，68℃延伸10min。产物经电泳回收纯化。

　　1.3酶切及连接反应　用限制性内切酶Bam HⅠ、Hind Ⅲ双酶切 pET22a(+)-TRX 及 GP73PCR 产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测并分别回收，T4DNA 连接酶连接，连接后构建pET22a(+)-TRX-GP73。

　　1.4重组质粒转化感受态细菌DH5α　将100μLDH5α 感受态细菌放入提前预冷的无菌离心管中，加入5μL 连接产物，混匀后冰上静置30min；42℃热激90s 后，立即置于冰上2min；将热激后的细菌加入900μL LB 液体培养基中（37℃预热），100rpm，37℃振摇45min；取100μL菌液涂布于含50μg·mL-1Amp 的 LB 琼脂平皿上，于37℃细菌培养箱中倒置培养12～16h。

　　1.5重组质粒的鉴定　从转化平皿中挑取单菌落进行扩大培养，用菌落 PCR、双酶切鉴定。选取经双酶切鉴定和菌落 PCR 均为阳性的克隆送上海英骏生物技术有限公司进行DNA 双向测序验证。

　　1.6重组蛋白TRX-GP73的原核表达及纯化从 DH5α中抽提重组质粒pET22a（+）-TRX-GP73，将重组质粒转入大肠杆菌 BL21（DE3）中，IPTG 诱导表达。为了获得蛋白表达的最佳 IPTG 诱导浓度、诱导时间和诱导温度，本实验选择的 IPTG 终浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mmo·lL-1，并分别于30℃、37℃条件下诱导1h、2h 、4h、6h、8h、10h后收集细菌，进行 SDS-PAGE 电泳鉴定，选择最佳诱导条件诱导表达。然后，按 ToYoBo His-tag 磁珠纯化试剂盒说明书步骤纯化目的蛋白 GP73，纯化产物经 SDS-PAGE 电泳鉴定。

　　2、结果

　　2.1目的基因的扩增　抽提 HepG2细胞总 RNA，RNA 质量好，无降解，以 RNA 为模板，RT-PCR 扩增 GP73基因的全长阅读框架序列，PCR 产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，在1200bp 可见清晰条带，大小与预期相符。目的基因经测序，大小与理论值一致，无突变，无移码现象。

　　2.2酶切及连接反应　pET22a(+)-TRX 及 GP73PCR 产物用限制性内切酶 Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切，37℃水浴过夜后，1％琼脂糖凝胶电泳并回收，按照 PCR 产物 / 载体3:1的摩尔比率将双酶切后的PCR 回收产物载体连接。

　　2.3重组质粒的鉴定　从转化平皿中挑取单菌落进行扩大培养，用菌落 PCR、双酶切鉴定（图1），选取两者均为阳性的克隆送上海英骏生物技术有限公司进行 DNA 双向测序验证。测序结果经比对，其大小与理论值一致，无突变，无移码现象，GP73基因序列已成功插入空载体 pET21a(+)-TRX 中。结果表明成功地构建了重组质粒 pET21a(+)-TRX-GP73。

　　2.4重组蛋白TRX-GP73的原核表达及纯化实验结果提示，重组蛋白 TRX-GP73的最佳诱导条件为1.0mmol·L-1，10h，37℃（图2）。将转入 pET21a(+)-TRX-GP73的表达菌株 E.ColiRosetta(DE3)经1.0mmo·lL-1IPTG诱导10h后裂解，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE 电泳发现 GP73主要以可溶性的形式存在于上清中，将上清经 His-tag 磁珠纯化试剂盒纯化后可在80kD 左右见一清晰目的条带，与预期相符（图3）。

　　3、讨论

　　2000年，美国学者 Kladney 等在研究成人巨大细胞性肝炎 (giant-cellhepatitis, GCH) 时，第一次发现了定位在高尔基体上的蛋白 GP73，人 GP73基因位于第9号染色体，全长3042bp，编码大小为73kD 的糖蛋白，称为GP73蛋白质研究表明 GP73在正常人体的多个器官组织中均有表达，推测该蛋白质具有管家基因功能，但表达水平相差很大，表明 GP73可能存在组织和（或）细胞的特异性调控。在正常肝脏中，大部分肝细胞不表达 GP73，仅有少量位于汇管区的肝细胞低表达 GP73。

　　2002年，Kladney 等发现 GP73高表达于肝炎和肝硬化患者的肝组织中，表达量是正常肝组织的70倍，而各病理组之间无显著差异。2004年，Iftikhar 等研究同样发现 GP73在急性肝炎和进行性肝硬化患者中表达明显增高。2005年，Marrero采用蛋白质印迹技术对144例肝癌患者、152例肝硬化患者及56例健康对照者的血清标本进行分析，以10个相对强度单位作为阀值，GP73检测肝癌的灵敏度为69％，特异性为75％。而GP73用于早期肝癌诊断的敏感性为62％，远高于AFP（25％）。AFP 水平低于20μg·L-1的肝癌患者中，57％（32/56）的 GP73水平显著升高。

　　2013年，Shan SG 等研究发现，GP73在血清中的表达水平随慢性肝病的进展（肝炎 -肝硬化 -肝癌）而逐渐升高，提示其可作为慢性肝病患者疾病恶化的预警指标。

　　现有的研究表明 GP73与肝脏疾病密切相关，尤其在肝癌患者血清及肝癌组织中呈现高表达，因此有望成为肝癌早期诊断的血清标志物。本研究从肝癌细胞系中克隆 GP73基因，采用基因重组技术构建 pET-21a(+)-TRX-GP73原核表达载体，摸索最佳的 IPTG 诱导表达条件，使其在 BL21（DE3）中得以高效表达，并采用 His-tag 磁珠吸附、洗脱重组蛋白 GP73。我们通过试验对比发现：与Ni- 柱纯化法相比较，虽然 His-tag 磁珠法纯化的蛋白浓度较低，但是能显著提高GP73蛋白的纯度，为后续的研究提供了更优质的蛋白样品。