采用新型方法处理的肺动脉带瓣管道的可行性,医学工程论文

　　目前,临床应用的肺动脉带瓣管道无论是人工材料还是生物材料均无活性,与自身组织相容性差,术中易出血,可能诱发血栓形成等近期并发症,远期易因钙化、衰败等导致管道狭窄,甚至闭塞,需二次手术治疗。因其无活性,在受体内不能重塑、生长、修复,在小儿心脏手术中的应用明显受到限制。因此,研制理想的组织型肺动脉带瓣管道是心脏外科临床迫切需要解决的课题。本研究探讨采用新型方法处理的肺动脉带瓣管道的可行性,报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般材料

　　12周龄幼年家猪,宰杀后20min内无菌条件下取出心脏,无菌生理盐水冲洗干净后,将肺动脉瓣连同其上2cm肺动脉取出,沿肺动脉瓣膜交界处纵向剪开分成3份,随机分为3组,每份均由部分肺动脉管壁与其相应瓣膜组织组成。将裁剪好的样本浸泡于络合碘溶液消毒1h,PBS充分清洗后,于含有双抗的DHanks液中4℃下保存24h。

　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 分组
　　新鲜肺动脉瓣膜组(对照组):为新鲜猪肺动脉带瓣管道组织,不作进一步处理。去细胞瓣膜组(去细胞组):采用胰蛋白酶+去污剂TritonX-100方法对猪的带瓣肺动脉管道样本进行去细胞处理。明胶嵌合去细胞瓣膜组(明胶嵌合组):在去细胞组处理基础上进一步行明胶嵌合处理。

　　1.2.2 组织相容性实验
　　参考崔彬等方法,将3组样本分别经60Co 120万拉德照射消毒备用。SD清洁级雄性大鼠36只,体质量250~300g,由北京动物实验中心提供。戊巴比妥腹腔麻醉(50mg/kg),将大鼠俯卧位固定于手术台上,背部两侧备皮,消毒铺巾。在大鼠背部脊柱两侧各作一切口,长0.8~1.0cm,相互间距3cm,游离皮下组织,形成皮下腔隙,分别放入3组样本,间断缝合皮肤,喂养8周。所有大鼠顺利康复,无死亡及伤口感染。

　　8周后,应用颈椎脱臼法处死大鼠,仔细游离皮下组织,完整取出组织。常规石蜡包埋切片,行HE染色观察组织结构及炎性反应变化;Van Kosaa银染色法定性分析、原子吸收光度计法定量分析组织的钙化程度。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS 17.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(珚x±s)表示,比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠皮下包埋试验

　　对照组肺动脉瓣膜及管壁组织中有大量炎性细胞浸润,以淋巴细胞浸润明显。

　　去细胞组炎性反应明显下降,仅可见少量淋巴细胞、嗜酸粒细胞浸润。明胶嵌合组未见中性粒细胞和淋巴细胞浸润,视野中内可见纤维细胞。见图1-2。【图1-2.略】
　　
　　2.2 组织钙化程度定性分析

　　对照组瓣膜和管壁组织中可见呈黑色颗粒的大量钙盐沉积,尤其以管壁组织明显。去细胞组钙盐沉积明显减少。明胶嵌合组视野内几乎未见钙盐沉积,仅在动脉壁深层可见少量针尖样小黑色颗粒。

　　2.3 钙化程度定量分析

　　皮下包埋8周后,对照组、去细胞组、明胶嵌合组肺动脉管壁组织钙盐含量分别为(19.47±0.83)、(1.39±0.11)、(0.14±0.03)mg/g,肺动脉瓣膜组织钙盐含量分别为 (16.68±0.74)、(0.60±0.07)、(0.06±0.01)mg/g,去细胞组肺动脉瓣膜和管壁组织钙盐含量较对照组明显下降,明胶嵌合组较去细胞组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨论

　　在心脏外科领域,右心室流出道重建术(右心室-肺动脉)是自体肺动脉瓣移植术(Ross手术)和多种复杂先天性心脏病(如肺动脉闭锁、右心室双出口、大动脉转位、共同动脉干等)解剖矫治的主要内容之一,肺动脉带瓣管道是重建右心室流出道的必需材料。理想肺动脉带瓣管道应是无免疫原性、有活性的组织材料,具有耐久性好、远期无钙化和衰败、可随身体发育而生长、不需二次手术且材料来源广泛、型号多样等特性,能满足不同年龄段患者需要。近年来,组织工程学的发展为研制理想的肺动脉带瓣管道带来了希望。

　　猪肺动脉在形态结构、组织成分、机械强度和黏弹性方面与人肺动脉十分相似,常被视作良好的肺动脉替代品。但异种动物组织在人体内引起的排异反应是造成该组织衰败的主要原因。组织中内皮细胞和间质细胞表面表达的组织相容性Ⅰ和Ⅱ类蛋白是引起免疫排异反应的主要抗原。为降低异种肺动脉的免疫原性,目前主要采用组织工程学方法去除这些细胞,以获得低免疫原性的猪肺动脉组织,然后在体外种植受体细胞,构建出“自体”的肺动脉组织。但这种体外种植宿主细胞的方法仍有较多局限性,除体外种植的内皮细胞黏附能力低外,在植入体内后极易脱落,且生理功能、机械性能与正常瓣膜相比明显不足,并难以避免易钙化、形成血栓的问题。

　　根据免疫学原理,活体组织在保持该组织活性前提下对其抗原位点进行有效完全封闭处理,可消除其诱发的排异反应特性。体内埋植试验是检测生物材料组织相容性必不可少的方法之一,可直接观察动物机体对材料中同种或异种抗原以及材料中化学物质所产生的免疫应答。本研究结果显示,大鼠皮下移植8周后,对照组中有大量炎性细胞浸润,以淋巴细胞浸润为主;去细胞组炎性反应明显下降,仅可见少量淋巴细胞、嗜酸粒细胞浸润;明胶嵌合组未见中性粒细胞和淋巴细胞浸润;去细胞组和明胶嵌合组视野内可见纤维细胞长入,说明去细胞后猪肺动脉植入体内具有生长潜力。钙盐染色结果显示,对照组可见呈黑色颗粒的大量钙盐沉积,以管壁组织明显,表明大量钙盐沉积,去细胞组钙盐沉积明显减少,明胶嵌合组视野内几乎未见钙盐沉积,仅在动脉壁深层可见少量针尖样小黑色颗粒;钙含量测定显示,去细胞组钙盐含量较对照组明显下降,明胶嵌合组钙盐含量较去细胞组明显下降,提示明胶嵌合去细胞瓣膜免疫原性明显下降,移植后免疫反应减轻,组织钙化程度下降,具有良好组织相容性和生长潜力,有望成为一种新型的肺动脉带瓣管道支架材料。

　　参考文献
　　
　　[1]Yacoub M.Viewpoint:heart valve engineering.Interview byJames Butcher[J].Circulation,2007,116(8):f44-46.
　　[2] 崔彬,刘迎龙,谢宁,等.去细胞组织工程同种心脏瓣膜的免疫学特征[J].中华实验外科杂志,2005,22(12):1051-1053.
　　[3] 张燕搏,王强.组织工程化血管研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2012,26(4):313-315.
　　[4] 张燕搏,姜明,王强,等.动态反应器构建组织工程化血管的初步实验研究[J].中华实用诊断与治疗杂志,2011,25(11):1047-1049.
　　[5] 张燕搏,姜明,王强,等.组织工程血管材料体外细胞毒性评价实验研究[J].中华实用诊断与治疗杂志,2011,25(6):539-542.