获取虫草素的化学合成方法

　　虫草素又称 3'-脱氧腺苷，由 Cunningham[1]于 1950 年第一次从蛹虫草中分离得到。生物学研究发现虫草素具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒、消炎等[2]广谱生物活性和药理作用。近年来研究人员发现虫草素可能具有增强人类免疫力[3]和清除因老龄化引起的体内自由基的功效[4].另外，临床上已有以虫草素为主要成分的新药用于白血病的治疗[5],应用前景良好，因此具有巨大的市场潜力。但是，虫草素纯品的获得非常不易，因此国际市场上虫草素的价格非常昂贵。

　　目前，虫草素纯品主要通过从人工培育的蛹虫草中提取分离得到，操作繁琐、制备成本较高[6].为了大规模的获取虫草素用于生物活性研究，我们首先尝试了对虫草花进行分离，但是最终只获得 500 mg 样品，纯度约 93%.该方法成本太高，因此我们试图通过化学合成的方法获取虫草素。

　　通过对骨架分析可知，虫草素由一个 3-脱氧的核糖和腺嘌呤进行糖苷化连接而成。目前文献报道的虫草素的化学合成工艺主要有两种： 一是以腺苷（ 1） 为原料，通过将1 的3'-位羟基溴代，接着用自由基还原去除 3'-位的卤素制备虫草素[7];二是利用木糖为原料通过多步基团保护，单独裸露出 3-位羟基，接着用自由基还原反应制得 3-脱氧核糖，再与 1 进行糖苷化连接制得虫草素[8].

　　本文以 1 为原料[9],经 3 步反应简单快速地合成了虫草素。即 1 与原乙酸三甲酯在醋酸作用下反应制得 2',3'-羟基原酸酯化的中间体（ 2） ,接着加入乙酰溴，水解 2',3'-原酸酯，通过一锅两步法以 40. 5% 的收率制得 2',5'-O-二乙酰基-3'-溴代腺苷（ 3） ; 3 在三丁基氢化锡和偶氮异二丁腈（ AIBN） 作用下经还原脱溴反应制得 2',5'-O-二乙酰基-3'-脱氧腺苷（ 4） ; 4 经水解去除糖环羟基上的乙酰基合成了虫草素，3 步总收率 29. 8%,纯度 >95%,其结构经1H NMR和 MS 确证[7].本文还重点对 3 的合成条件进行了优化。

　　1 实验部分
　　
　　1. 1 仪器与试剂
　　
　　UV1900 型双光束紫外分光光度计； Bruker400 MHz 型核磁共振仪 （ DMSO-d6为溶剂，TMS为内标） ; Hitachi 型高效液相色谱仪； 5500 Q-Trap型液质联用仪。

　　高效薄层层析板，青岛海浪； 柱层析用硅胶，200 目 ~ 300 目，青岛海洋化工厂； Sephendex LH-20,北京绿百草公司； 其余所用试剂均为分析纯，爱斯特试剂公司，其中醋酸、甲苯和甲醇使用前经干燥和纯化。

　　1. 2 合成
　　
　　（ 1） 3 的合成在反应瓶中依次加入 1 10. 0 g（ 37. 5 mmol）和冰醋酸 75 mL,氮气保护，水浴冷却，搅拌下缓慢滴加原乙酸三甲酯 14. 4 mL（ 112 mmol） ,滴毕；于室温反应过夜（ TLC 检测） ; 冰水浴冷却下反应15 min; 缓慢滴加乙酰溴 7. 6 mL（ 93. 7 mmol） （ 30min） ; 升温至 20 ℃ ,反应 6 h（ TLC 检测） .低温蒸去大部分乙酸和过量乙酰溴，残余物用氯仿（ 80mL） 溶解，用饱和 NaHCO3溶液调至 pH 7 ~8,依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂后经硅胶柱层析[洗脱剂： A = V（ DCM） ∶ V（ MeOH） =15 ∶1]纯化得黄色油状物 3 6. 26 g,收率40.5%; MS m/z: 414,416{ [M +H]+} .

　　（ 2） 4 的合成在反应瓶中加入 3 5. 53 g（ 13. 4 mmol） 和无水甲苯 67 mL,搅拌使其溶解； 加入 AIBN 0. 44 g（ 2. 68 mmol） ,于室温反应 10 min; 氮气保护下滴加三丁基氢化锡 5. 8 g（ 20. 1 mmol） ,滴毕； 回流（ 110 ℃） 反应 2 h（ TLC 检测） .倾入 100 mL 轻石油醚中（ 析出淡黄色固体） ,过滤，滤饼用冰轻石油醚洗涤得 4 粗品 3. 87 g,收率 87. 0%,直接进行下步反应。

　　（ 3） 虫草素的合成[8]在反应瓶中依次加入无水甲醇 37 mL 和 4640 mg（ 1. 87 mmol） ,搅拌使其溶解； 回流反应 3 h（ TLC 检测） .缓慢冷却至室温，减压浓缩后经Sephendex LH-20 柱层析[洗脱剂： V （ H2O） ∶ V（ MeOH） =10 ∶ 1]纯化得淡黄色固体虫草素 405mg,收率 85. 1% ,Rf= 0. 3 （ 展开剂： A = 4 ∶ 1） ,m. p. 226 ℃ ~ 228 ℃，[α]20D- 35. 2 ° （ c 0. 10,MeOH） ; UV-Vis （ CH3OH） λmax: 213,260 nm;1H NMR δ： 8. 36（ s,1H,2-H） ,8. 15（ s,1H,8-H） ,7. 30 （ s,2H,NH2） ,5. 87（ d,J = 6. 0 Hz,1H,1'-H） ,5. 69 （ d,J = 5. 6 Hz,1H,2'-H） ,5. 19 ~ 5. 17 （ m,1H,5'-OH） ,4. 57 （ s,1H,2'-OH） ,4. 34（ s,1H,4'-H） ,3. 69 ~ 3. 66（ m,1H,5-Ha'） ,3. 51 ~3. 46（ m,1H,5-Hb'） ,2. 27 ~2. 20（ m,1H,3-Ha'） ,1. 93 ~1. 90（ m,1H,3-Hb'） （ 与文献[8]值一致） ; MS m/z: 274. 1{ [M + Na]+} .
　　
　　2 结果与讨论
　　
　　2. 1 合成
　　
　　本文参照文献方法通过两步反应合成 3: 一是 1 的环化； 二是乙酰溴开环。实验中我们发现该反应虽然收率较好，但伴随生成的副产物 5（ Chart 1） 较多，很难分离纯化。其次，第一步反应产物 2 在乙酸乙酯、二氯甲烷及乙醚中的溶解性均较差，只在氯仿中有一定的溶解度。因此，萃取时氯仿用量较大。此外，由于第二步反应中DMSO 会干扰反应的进行（ DMSO 会和原位生成的 HBr 反应） ,所以需要将其尽量除净。文献方法通过大量水洗和柱层析处理，后处理操作步骤较为繁琐。在第二步溴解反应中，我们发现按文献方法操作，3/5 = 4/1,选择性不理想，给后处理分离纯化带来了较大困难。
　　
　　2. 2 反应条件优化
　　
　　在 1 的原酸酯化反应中，为了克服现有方法的缺点，寻找更加合理的合成工艺，对反应的溶剂进行了筛选，考察不同溶剂对反应的影响，结果见表 1.由表 1 可见，以 DMSO 为溶剂时，2 收率82% ; 以醋酸和 DMF 为溶剂时，收率较高，分别为72% 和 65% ,且杂质较少，可以作为 DMSO 的替代溶剂； 乙腈和二氯甲烷为溶剂时收率较低，不能作为替代溶剂。

　　在 2 的溴解反应过程中，考察了溶剂对反应的影响，结果见表 2.首先参照文献[9]方法以乙腈为溶剂时，以 78% 的收率获得 3 和 5 的混合物，3/5 =4/1[较文献值（ 6/1） 稍低]; 尝试以乙酸为溶剂，3 和5 总收率为 63%,3/5 最佳能达 6/1.

　　因此在进行溴解反应时，乙酸可作为较佳溶剂。【1】

　　
　　鉴于此，可将原酸酯化反应和溴解反应合并进行，反应以 40. 5%收率制得 3 和 5,3/5 =6/1.该方法提高了反应选择性的同时也简化了后处理程序。由于醋酸的沸点相对较低，因此可以在低温下将乙酸和过量乙酰溴蒸馏出，大大简化了后处理难度。但是反应选择性一般，需进一步改进以利于工业化生产。

　　3 结论
　　
　　以廉价易得的腺苷（ 1） 为原料，经 3 步反应以 29. 8%总收率成功合成了具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒活性的天然产物虫草素。合成中间体 2',5'-O-二乙酰基-3'-溴代腺苷的最佳反应条件为： 137. 5 mmol,醋酸 75 mL（ 作为溶剂和催化剂） ,将原乙酸三甲酯 112 mmol 在冰水浴条件下缓慢滴加入体系，于室温反应过夜； 冰浴条件下，将乙酰溴 93. 7 mmol 在 30 min 内缓慢滴加入反应体系，于 20 ℃反应 6 h,收率 40. 5%.该改进方法为虫草素工业化合成提供了新的途径。