玉铃花种子生物学特性研究材料与方法

【题目】玉铃花种子休眠解除的理化变化探究 
【1.1】玉铃花的基本概况 
【1.2】种子休眠特性研究 
【第二章】玉铃花种子生物学特性研究材料与方法 
【第三章】萌发过程中种子生理生化变化的研究结果与分析 
【第四章】玉铃花种子萌发生理研究讨论 
【结论/参考文献】玉铃花种子发芽中生理生化特点研究结论与参考文献

　　2.材料与方法

　　2.1 实验材料

　　实验用玉铃花种子采自河南，在成年玉铃花树上采集果实，经晾晒揉搓得到种子，去杂备用。测种子生活力种子为大白菜种子。

　　2.2 实验设计与研究方法

　　2.2.1 种子生物学特性研究

　　2.2.1.1 种子的形态特征

　　随机抽取 50 粒玉铃花种子，观察其形状、颜色、质感、光滑度等方面，总结种子的形态特征。用游标卡尺测定种子的横轴直径（W）、纵轴直径（L）、种子厚度，计算其平均值。采用千粒法测定玉铃花种子的千粒重，采用四分法随机抽取 1000 粒种子为一组，共取 3 组，分别用 1/1000 天平称重 ,读数精确到小数点后两位，计算三个数的平均值即为种子的千粒重。

　　2.2.1.2 种子的含水量

　　采用 105℃烘箱法测定玉铃花种子中自由水的含量。测定时，取适量玉铃花种子，精确称重（W1）后，于 80℃恒温干燥箱内预烘 2-3h,然后于 105 士 2℃烘至重量不再变化，冷却后称重（W2），则种子相对含水量的计算公式为：

　　相对含水量（RWC）=（ W1- W2）/ W1

　　2.2.1.3 种子生活力测定

　　采用TTC染色法快速测定种子生活力。随机选取种子，设置3个重复，每个重复取50粒种子。将待测种子用水浸泡24h,待种子充分吸胀后，用单面刀片沿胚乳（胚）的中线纵切成均等的两半，将其中一半放在培养皿中，加入适量的0.5%TTC溶液，以淹没种子为标准，将另一半在沸水中煮5min杀死胚，然后置于40℃染色6h,用自来水反复冲洗种子，直至所染颜色不再洗出为止，观察种子胚部的染色情况，算出具有生活力的种子百分率。

　　对玉铃花种子生活力测定的判读依据以下标准：○1 有生活力种子：胚和胚乳全部正常染色；胚全部被染色，胚乳少量未染色。○2 无生活力种子：胚和胚乳全部未染色；胚全部染色，胚乳未染色；胚未染色，胚乳大部分染色。

　　2.2.2 种子休眠原因

　　2.2.2.1 种子透水性测定

　　通过绘制种子吸水曲线图测定种子透水性。分别随机抽取完整种子、破皮种子（将种皮敲出一条裂缝）各50粒，称重后放在 25℃的恒温培养箱中，用去离子水浸泡种子。

　　每隔两小时取出种子（12h后，每12h取一次），用吸水纸吸干种子表面的水分，在 1/1000电子天平上称重，直至种子重量不再变化为止。每处理设置 3 个重复，计算其吸水率。

　　吸水率（%）=（吸水后质量（g）-吸水前质量（g））/吸水前质量（g）×100%

    2.2.2.2 种子各部分萌发抑制物的生物测定

　　取饱满玉铃花种子，将种皮和胚乳（含胚）分开后，分别称取2.5g,用液氮迅速冷冻，用5ml 80%的甲醇研磨，将研磨液分别倒入100ml锥形瓶中，再各用80%甲醇多次清洗16研钵，将研磨液与清洗液合并，倒入同一锥形瓶中，最后以80%甲醇分别定容至50ml,摇匀后 ,用封口膜封口，放入4℃震荡培养箱中浸提， ,浸提48小时后取出，在4℃ 6000rpm条件下离心1min,离心后将上清液倒入150ml锥形瓶中，沉淀再以80%甲醇定容至50ml浸提，用震荡仪振荡搅拌，至充分混合，4℃条件下再次离心，操作同上，分别合并两次离心的上清液于，锥形瓶中，用真空旋转蒸发仪，设置转速80r/min,水域温度为40℃，减压旋转蒸发掉甲醇，直至剩余全部为水相，用蒸馏水定容至40ml,即得玉铃花种皮与胚乳中内源抑制物质的浸提液原液。将浸提液原液分别稀释，稀释浓度分别为原液浓度的20%、40%、60%、80%、100%（20%浸提液既将浸提液原液稀释为原浓度的20%的溶液，40%、60%、80%、100%浸提液稀释原理同上）。

　　在上述提取液中各放白菜籽50粒，浸泡两小时。在培养皿中放两层滤纸，分别取各浓度的提取液2ml浸湿滤纸，将各浓度浸泡的白菜籽放入培养皿中，后分别取各对应浓度的浸提液5ml,对白菜籽进行抑制物活性测定，以同体积的蒸馏水作为对照，每个处理三个重复。在培养箱中，进行白菜籽发芽试验，48h统计白菜籽发芽率（以露出子叶为发芽标准），72h测其苗高和根长。本实验所用的白菜籽为北京益丰惠农农业科技研究所的四季小白菜，纯度95.0%,净度98.0%,发芽率85%,含水量约为8.0%.

    2.2.3 层积过程中种子生理生化变化的研究

    本实验采用低温层积，层积前经 0.3%高锰酸钾消毒 30min 后，用 30-40℃温水浸泡24h,将沙子与种子以 3:1 的比例混匀（层积所用沙含水量保持在 60%左右），后装入容器中，埋藏深度约 50cm,宽 70cm,后培土，顶部形成丘状即可，从沙藏开始每隔 30 天取种一次，分别测定种子的含水量，可溶性糖、淀粉、蛋白质含量以及淀粉酶活性变化。层积历时 5 个月，总共 150 天。

　　2.2.3.1 含水量测定

　　取层积中的种子，用水冲洗干净表面的沙粒，然后用滤纸吸干表面的水滴，称取每20 粒种子为一组，重复三次，记录重量（精确到小数点后第三位）。将称量瓶预先烘至恒重并编号，把三份测定样品分别装入对应的称量瓶中，并记下称量瓶重和瓶号。然后称量，记下读数。将称量瓶放入烘箱中，敞开盖子，从温度回升到 105℃时开始计时，连烘 8h.取出后盖上盖子，放入干燥器中冷却 15-20min.取出称重，记录读数。再敞开盖用 105℃烘 2h,再按上法称重，记下读数。直到前后两次的重量之差小于 0.01g 时，即认为已达到恒重，种子干重即为恒重时的重量。种子含水率的计算：根据测定结果，按下式分别计算 3 份测定样品的相对含水量百分率，精度到小数点后一位。

种子含水率（%）=（测定样品烘干前重-测定样品烘干干重）/测定样品烘干前重

　　2.2.3.2 可溶性糖含量测定

　　采用蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉含量。具体操作如下：称取1.0g种子，放入25ml试管中，加沸水 25mL,放在水浴锅中加盖煮沸 10min,放置冷却后过滤在 50mL 的容量瓶中，加水定容，便为可溶性糖的提取液。用移液枪吸取提取液 0.5mL 于大试管中，加入蒸馏水 1.5mL, 2%蒽酮试剂 0.5mL,再加入浓硫酸 5mL,摇匀，静置 10min,在620nm 波长下比色，记录吸光度，在标准曲线上查出对应的葡萄糖的含量。再按下列公式进行计算，得出样品中可溶性糖的含量。设定 3 个重复。种子样品含糖量（mg/g）=[查表所得的糖量（mg）×样品稀释倍数]/样品重（g）

    2.2.3.3 可溶性淀粉含量测定

　　在提取可溶性糖后剩余的干燥残渣中加 20mL 蒸馏水，放入沸水浴中煮沸 15min,再加入 2mL 9.2mol/L 高氯酸溶液，提取 15min,冷却后过滤，定容，摇匀。吸取滤液 0.5mL于大试管中，加蒸馏水 1.5mL,2%蒽酮试剂 0.5mL,再加入浓硫酸 5mL,微微摇动，当管内出现葱酮絮状物时，再剧烈摇动促进葱酮溶解，然后立即放入沸水浴中加热 10min,冷却后在 620nm 波长下比色，记录吸光度。在标准曲线上查出对应的淀粉含量，再按下列公式进行计算。每个样品设定 3 个重复。

　　样品淀粉含量（mg/g）：[查表所得的淀粉含量（mg）×样品稀释倍数]/样品重（g）

    2.2.3.4 可溶性蛋白含量测定

　　采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量，具体操作如下：称取 1.0g 种子，加 4mL蒸馏水，使用 FS-2 型可调高速分散器研磨成匀浆，转移到离心管中，再用 4mL 蒸馏水洗涤，一并转入离心管中，然后在 10000r/min 下离心 30min,过滤，取提 0.1mL 取液于试管中，然后加入 G-250 溶液 5mL,充分混合，放置 2min 后在 595nm 下测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。设定 3 个重复。

　样品淀粉含量（mg/g）：[查表所得的淀粉含量（mg）×样品稀释倍数]/样品重（g）

　　18洗涤，一并转入离心管中，然后在 10000r/min 下离心 30min,过滤，取提 0.1mL 取液于试管中，然后加入 G-250 溶液 5mL,充分混合，放置 2min 后在 595nm 下测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。设定 3 个重复。

　　样品中蛋白质含量=（C×VT）/（VS×WF）[mg/g]

　　C 为查标准曲线值，mg;VT为提取液总体积，mL;Vs 为测定时加入的提取液的量，mL;WF为样品的鲜重，g

    2.2.3.5  淀粉酶含量测定

　　淀粉酶活性测定采用李合生的方法，具体操作如下：称取 1g 左右的种子，加入 4mL的蒸馏水，用 FS-2 型可调高速分散器研磨成匀浆，再用 4mL 蒸馏清洗研钵，混均后将提取液在室温下（25℃）放置提取 15-20min,每隔几分钟搅动一次，使其充分提取。然后在温度为 0-4℃转速为 10000r/min 条件下离心 30min,过滤后即为淀粉酶原液备用。

　　α-淀粉阵活性的侧定：

　　取 3 支试管（ 1 支为对照管，2 支为测定管），在各管中加 lmL 酶提取液，在 70℃恒温水浴中准确加热 15min,取出后迅速在自来水中冷却，再向对照管中加入 2mL 的 3,5-二硝基水杨酸试剂。然后将试管都置于 40℃士 0.5℃恒温水浴中预保温 10min,再向各管中分别加入 40℃下预热的 1%淀粉溶液 1mL,摇匀后，立即放入 40℃士 0.5℃水浴中准确保温 5min 后取出，向各测定管迅速加入 2mL 的 3,5-二硝基水杨酸试剂，以终止酶的活性。摇匀，各试管置于沸水浴中 5min,取出后冷却，加 10mL 蒸馏水。摇匀，在 540nm 波长下比色，测定吸光度。

　　α+β-淀粉酶活性的侧定：

　　取 3 支试管（1 支为对照管，2 支为测定管），向每管中加 lmL 酶提取液，再向对照管中加入 2mL 的 3,5-二硝基水杨酸试剂。然后将测定管和对照管置于 40℃士 0.5℃恒温水浴中保温 10min,再向各管中分别加入 1mL 40℃下预热的 1%淀粉溶液，摇匀后，立即放入 40℃士 0.5℃水浴中准确保温 5min 后取出，向各测定管迅速加入 2mL 的 3,5-二硝基水杨酸试剂，以终止酶的反应。摇匀，各试管置沸水浴中准确煮沸 5min,取出后冷却，加 10mL 蒸馏水。摇匀，在 540nm 波长下进行比色，测定吸光度。

　　从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，然后按下列公式进行计算。

　　样品中蛋白质含量=（C×VT）/（VS×WF）[mg/g]

　　C 为查标准曲线值，mg;VT为提取液总体积，mL;

　　Vs 为测定时加入的提取液的量，mL;WF为样品的鲜重，g