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玉铃花种子生物学特性研究材料与方法

来源:学术堂 作者:周老师
发布于:2016-08-16 共3886字

【题目】玉铃花种子休眠解除的理化变化探究 
【1.1】玉铃花的基本概况 
【1.2】种子休眠特性研究 
【第二章】玉铃花种子生物学特性研究材料与方法 
【第三章】萌发过程中种子生理生化变化的研究结果与分析 
【第四章】玉铃花种子萌发生理研究讨论 
【结论/参考文献】玉铃花种子发芽中生理生化特点研究结论与参考文献


  2.材料与方法

  2.1 实验材料

  实验用玉铃花种子采自河南,在成年玉铃花树上采集果实,经晾晒揉搓得到种子,去杂备用。测种子生活力种子为大白菜种子。

  2.2 实验设计与研究方法

  2.2.1 种子生物学特性研究

  2.2.1.1 种子的形态特征

  随机抽取 50 粒玉铃花种子,观察其形状、颜色、质感、光滑度等方面,总结种子的形态特征。用游标卡尺测定种子的横轴直径(W)、纵轴直径(L)、种子厚度,计算其平均值。采用千粒法测定玉铃花种子的千粒重,采用四分法随机抽取 1000 粒种子为一组,共取 3 组,分别用 1/1000 天平称重 ,读数精确到小数点后两位,计算三个数的平均值即为种子的千粒重。

  2.2.1.2 种子的含水量

  采用 105℃烘箱法测定玉铃花种子中自由水的含量。测定时,取适量玉铃花种子,精确称重(W1)后,于 80℃恒温干燥箱内预烘 2-3h,然后于 105 士 2℃烘至重量不再变化,冷却后称重(W2),则种子相对含水量的计算公式为:

  相对含水量(RWC)=( W1- W2)/ W1

  2.2.1.3 种子生活力测定

  采用TTC染色法快速测定种子生活力。随机选取种子,设置3个重复,每个重复取50粒种子。将待测种子用水浸泡24h,待种子充分吸胀后,用单面刀片沿胚乳(胚)的中线纵切成均等的两半,将其中一半放在培养皿中,加入适量的0.5%TTC溶液,以淹没种子为标准,将另一半在沸水中煮5min杀死胚,然后置于40℃染色6h,用自来水反复冲洗种子,直至所染颜色不再洗出为止,观察种子胚部的染色情况,算出具有生活力的种子百分率。

  对玉铃花种子生活力测定的判读依据以下标准:○1 有生活力种子:胚和胚乳全部正常染色;胚全部被染色,胚乳少量未染色。○2 无生活力种子:胚和胚乳全部未染色;胚全部染色,胚乳未染色;胚未染色,胚乳大部分染色。

  2.2.2 种子休眠原因

  2.2.2.1 种子透水性测定

  通过绘制种子吸水曲线图测定种子透水性。分别随机抽取完整种子、破皮种子(将种皮敲出一条裂缝)各50粒,称重后放在 25℃的恒温培养箱中,用去离子水浸泡种子。

  每隔两小时取出种子(12h后,每12h取一次),用吸水纸吸干种子表面的水分,在 1/1000电子天平上称重,直至种子重量不再变化为止。每处理设置 3 个重复,计算其吸水率。

  吸水率(%)=(吸水后质量(g)-吸水前质量(g))/吸水前质量(g)×100%

    2.2.2.2 种子各部分萌发抑制物的生物测定

  取饱满玉铃花种子,将种皮和胚乳(含胚)分开后,分别称取2.5g,用液氮迅速冷冻,用5ml 80%的甲醇研磨,将研磨液分别倒入100ml锥形瓶中,再各用80%甲醇多次清洗16研钵,将研磨液与清洗液合并,倒入同一锥形瓶中,最后以80%甲醇分别定容至50ml,摇匀后 ,用封口膜封口,放入4℃震荡培养箱中浸提, ,浸提48小时后取出,在4℃ 6000rpm条件下离心1min,离心后将上清液倒入150ml锥形瓶中,沉淀再以80%甲醇定容至50ml浸提,用震荡仪振荡搅拌,至充分混合,4℃条件下再次离心,操作同上,分别合并两次离心的上清液于,锥形瓶中,用真空旋转蒸发仪,设置转速80r/min,水域温度为40℃,减压旋转蒸发掉甲醇,直至剩余全部为水相,用蒸馏水定容至40ml,即得玉铃花种皮与胚乳中内源抑制物质的浸提液原液。将浸提液原液分别稀释,稀释浓度分别为原液浓度的20%、40%、60%、80%、100%(20%浸提液既将浸提液原液稀释为原浓度的20%的溶液,40%、60%、80%、100%浸提液稀释原理同上)。

  在上述提取液中各放白菜籽50粒,浸泡两小时。在培养皿中放两层滤纸,分别取各浓度的提取液2ml浸湿滤纸,将各浓度浸泡的白菜籽放入培养皿中,后分别取各对应浓度的浸提液5ml,对白菜籽进行抑制物活性测定,以同体积的蒸馏水作为对照,每个处理三个重复。在培养箱中,进行白菜籽发芽试验,48h统计白菜籽发芽率(以露出子叶为发芽标准),72h测其苗高和根长。本实验所用的白菜籽为北京益丰惠农农业科技研究所的四季小白菜,纯度95.0%,净度98.0%,发芽率85%,含水量约为8.0%.

    2.2.3 层积过程中种子生理生化变化的研究

    本实验采用低温层积,层积前经 0.3%高锰酸钾消毒 30min 后,用 30-40℃温水浸泡24h,将沙子与种子以 3:1 的比例混匀(层积所用沙含水量保持在 60%左右),后装入容器中,埋藏深度约 50cm,宽 70cm,后培土,顶部形成丘状即可,从沙藏开始每隔 30 天取种一次,分别测定种子的含水量,可溶性糖、淀粉、蛋白质含量以及淀粉酶活性变化。层积历时 5 个月,总共 150 天。

  2.2.3.1 含水量测定

  取层积中的种子,用水冲洗干净表面的沙粒,然后用滤纸吸干表面的水滴,称取每20 粒种子为一组,重复三次,记录重量(精确到小数点后第三位)。将称量瓶预先烘至恒重并编号,把三份测定样品分别装入对应的称量瓶中,并记下称量瓶重和瓶号。然后称量,记下读数。将称量瓶放入烘箱中,敞开盖子,从温度回升到 105℃时开始计时,连烘 8h.取出后盖上盖子,放入干燥器中冷却 15-20min.取出称重,记录读数。再敞开盖用 105℃烘 2h,再按上法称重,记下读数。直到前后两次的重量之差小于 0.01g 时,即认为已达到恒重,种子干重即为恒重时的重量。种子含水率的计算:根据测定结果,按下式分别计算 3 份测定样品的相对含水量百分率,精度到小数点后一位。

种子含水率(%)=(测定样品烘干前重-测定样品烘干干重)/测定样品烘干前重

  2.2.3.2 可溶性糖含量测定

  采用蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉含量。具体操作如下:称取1.0g种子,放入25ml试管中,加沸水 25mL,放在水浴锅中加盖煮沸 10min,放置冷却后过滤在 50mL 的容量瓶中,加水定容,便为可溶性糖的提取液。用移液枪吸取提取液 0.5mL 于大试管中,加入蒸馏水 1.5mL, 2%蒽酮试剂 0.5mL,再加入浓硫酸 5mL,摇匀,静置 10min,在620nm 波长下比色,记录吸光度,在标准曲线上查出对应的葡萄糖的含量。再按下列公式进行计算,得出样品中可溶性糖的含量。设定 3 个重复。种子样品含糖量(mg/g)=[查表所得的糖量(mg)×样品稀释倍数]/样品重(g)

    2.2.3.3 可溶性淀粉含量测定

  在提取可溶性糖后剩余的干燥残渣中加 20mL 蒸馏水,放入沸水浴中煮沸 15min,再加入 2mL 9.2mol/L 高氯酸溶液,提取 15min,冷却后过滤,定容,摇匀。吸取滤液 0.5mL于大试管中,加蒸馏水 1.5mL,2%蒽酮试剂 0.5mL,再加入浓硫酸 5mL,微微摇动,当管内出现葱酮絮状物时,再剧烈摇动促进葱酮溶解,然后立即放入沸水浴中加热 10min,冷却后在 620nm 波长下比色,记录吸光度。在标准曲线上查出对应的淀粉含量,再按下列公式进行计算。每个样品设定 3 个重复。

  样品淀粉含量(mg/g):[查表所得的淀粉含量(mg)×样品稀释倍数]/样品重(g)

    2.2.3.4 可溶性蛋白含量测定

  采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量,具体操作如下:称取 1.0g 种子,加 4mL蒸馏水,使用 FS-2 型可调高速分散器研磨成匀浆,转移到离心管中,再用 4mL 蒸馏水洗涤,一并转入离心管中,然后在 10000r/min 下离心 30min,过滤,取提 0.1mL 取液于试管中,然后加入 G-250 溶液 5mL,充分混合,放置 2min 后在 595nm 下测定吸光度,并通过标准曲线查得蛋白质含量。设定 3 个重复。

 样品淀粉含量(mg/g):[查表所得的淀粉含量(mg)×样品稀释倍数]/样品重(g)

  18洗涤,一并转入离心管中,然后在 10000r/min 下离心 30min,过滤,取提 0.1mL 取液于试管中,然后加入 G-250 溶液 5mL,充分混合,放置 2min 后在 595nm 下测定吸光度,并通过标准曲线查得蛋白质含量。设定 3 个重复。

  样品中蛋白质含量=(C×VT)/(VS×WF)[mg/g]

  C 为查标准曲线值,mg;VT为提取液总体积,mL;Vs 为测定时加入的提取液的量,mL;WF为样品的鲜重,g

    2.2.3.5  淀粉酶含量测定

  淀粉酶活性测定采用李合生的方法,具体操作如下:称取 1g 左右的种子,加入 4mL的蒸馏水,用 FS-2 型可调高速分散器研磨成匀浆,再用 4mL 蒸馏清洗研钵,混均后将提取液在室温下(25℃)放置提取 15-20min,每隔几分钟搅动一次,使其充分提取。然后在温度为 0-4℃转速为 10000r/min 条件下离心 30min,过滤后即为淀粉酶原液备用。

  α-淀粉阵活性的侧定:

  取 3 支试管( 1 支为对照管,2 支为测定管),在各管中加 lmL 酶提取液,在 70℃恒温水浴中准确加热 15min,取出后迅速在自来水中冷却,再向对照管中加入 2mL 的 3,5-二硝基水杨酸试剂。然后将试管都置于 40℃士 0.5℃恒温水浴中预保温 10min,再向各管中分别加入 40℃下预热的 1%淀粉溶液 1mL,摇匀后,立即放入 40℃士 0.5℃水浴中准确保温 5min 后取出,向各测定管迅速加入 2mL 的 3,5-二硝基水杨酸试剂,以终止酶的活性。摇匀,各试管置于沸水浴中 5min,取出后冷却,加 10mL 蒸馏水。摇匀,在 540nm 波长下比色,测定吸光度。

  α+β-淀粉酶活性的侧定:

  取 3 支试管(1 支为对照管,2 支为测定管),向每管中加 lmL 酶提取液,再向对照管中加入 2mL 的 3,5-二硝基水杨酸试剂。然后将测定管和对照管置于 40℃士 0.5℃恒温水浴中保温 10min,再向各管中分别加入 1mL 40℃下预热的 1%淀粉溶液,摇匀后,立即放入 40℃士 0.5℃水浴中准确保温 5min 后取出,向各测定管迅速加入 2mL 的 3,5-二硝基水杨酸试剂,以终止酶的反应。摇匀,各试管置沸水浴中准确煮沸 5min,取出后冷却,加 10mL 蒸馏水。摇匀,在 540nm 波长下进行比色,测定吸光度。

  从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量,然后按下列公式进行计算。

  样品中蛋白质含量=(C×VT)/(VS×WF)[mg/g]

  C 为查标准曲线值,mg;VT为提取液总体积,mL;

  Vs 为测定时加入的提取液的量,mL;WF为样品的鲜重,g

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