梨 Pyrus 是世界范围栽培的主要果树树种之一。 2012 年中国梨的栽种面积为 108.55 万 hm2, 梨产量达到了 1 579 万 t[1], 为世界上梨产量最高、 面积最大的国家。 梨为落叶乔木, 树体较大, 而且结果周期较长, 因此, 梨的新品种选育不仅需要的时间长, 而且土地及劳动力投入耗费大。 目前, 中国梨品种选育方式主要包括杂交育种、 芽变选种、 实生选种、 辐射育种等[2]。 以上梨品种培育方法中除了辐射育种, 其他育种方式的效率都较低, 难以满足育种和生产实践的需求。 此外, 由于梨自身产生突变的效率比较低, 难以获得类似模式植物的突变体材料用于重要性状的内在机制研究, 因此, 开展梨突变体的创制具有重要的实践和科学意义, 是十分重要的研究工作。 甲基磺酸乙酯(EMS)是目前应用最为广泛, 效果最佳的化学诱变剂之一, 其诱变后代的突变频率高, EMS 处理玉米 Zea mays 花粉, 突变频率高达 78%[3], 且多为显性突变[4], 易于突变体的筛选。 EMS 已成功应用于水稻 Oryza sativa, 油菜 Brassi-ca napus 等 10 多种植物诱导突变体[5-15], 但在梨上的应用还未见报道。 为了探索适宜梨的突变体诱导技术体系, 本研究采用不同体积分数的 EMS 溶液处理杜梨 Pyrus betulaefolia 种子, 通过对种子萌发、 遗传位点变异率鉴定, 以及幼苗生长发育状态等检测, 筛选最适宜的 EMS 诱变处理体积分数, 以期获得梨的突变体, 为梨新品种的选育以及特异性状分子基础研究提供资源和种质材料。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为杜梨种子, 采集于南京农业大学国家梨工程研究中心江浦实验基地。 EMS 药剂由美国Sigma 公司生产。
1.2 诱变材料的准备
使用砂藏法层积 2 000 粒杜梨种子, 温度为 4 ℃, 湿度为 60%, 层积时间为 40 d, 在发现种子有80%左右尖端露白时即可使用 EMS 药剂进行处理 。 处理前先用蒸馏水将河沙洗净 , 再用蒸馏水浸泡24 h。
1.3 EMS 处理
将杜梨种子随机分成 10 组, 200 粒·组-1, 放入锥形瓶中。 使用 0.1 mol·L-1, pH 7.0 的磷酸缓冲液配置 EMS 溶液, 各组 EMS 的体积分数依次为 0 (ck), 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%,0.8%和 0.9%。 将配置好的 EMS 溶液分别加入各组, 将锥形瓶口封住, 摇匀, 处理 24 h 后使用硫代硫酸钠清洗种子 15 min, 再用双蒸水清洗 15 min, 将种子晾干后, 播种, 种子出芽时统计出芽率。
1.4 基因组 DNA 的提取
随机选取梨苗 20 株·组-1, 于春季采集幼嫩叶片, 液氮速冻后保存于-70 ℃。 使用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取 DNA[16], 在 10.0 g·kg-1琼脂糖凝胶上进行电泳检测 DNA 质量, 使用 Nan-odrop 超微量分光光度计调整质量浓度至 50 mg·L-1, DNA 样品保存于-20 ℃。
1.5 SRAP 标记检测遗传变异频率
从通用的相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)引物中筛选出多态性较好, 条带较为清晰的 10 对引物[16], 并对它们进行编号(表 1), 检测 EMS 处理后杜梨幼苗的遗传变异频率, 并进行重复验证。 聚合酶链式反应(PCR)体系(25.0 μL): 10×PCR 缓冲液(Mg2+) 2.0 μL, 2.5mmol·L-1dNTP 1.6 μL, 各引物 0.6 μL, 50~100 ng DNA 模板, Taq 酶 1.0×16.67 nkat(药剂购于 TakaRa公司)。 PCR 扩增所用程序: 94 ℃预变性 4 min, 94 ℃, 1 min, 35 ℃, 1 min, 72 ℃, 1 min, 5 个循环, 94 ℃变性 1 min, 55 ℃退火 1 min, 72 ℃ 1 min, 34 个循环后 72 ℃延伸 8 min, 应用 SensoquestLabcycle PCR 仪器进行扩增。
取 PCR 产物 1.5 uL 点样于质量浓度为 0.8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离, 以恒定功率 80W, 电泳 2.5 h, 染色液染色 15 min, 显色液显色 15 min 后拍照记录。 观察电泳图谱, 将各对引物变异位点处有条带的记为 “0”, 无条带的记为 “1”, 将数据录入 Excel 表格中, 计算变异条带总数和变异平均值。
1.6 幼苗的田间生长情况调查统计
幼苗定植田间后, 定期管理幼苗, 分别于 2012 年 12 月和 2013 年 12 月, 测量所有梨苗的植株高度和节间长度, 计算各组植株高度均值和平均节间长度, 并进行差异显着性分析。
2 结果与分析
2.1 不同体积分数 EMS 处理对杜梨种子发芽率的影响
统计各组 EMS 处理后杜梨幼苗发芽率, 结果显示: 不同体积分数 EMS 处理降低了梨苗的发芽率。
各组中, 发芽率最高的组为对照组, 其发芽率为 90.5%; 发芽率最低的组为第 10 组(体积分数为 0.9%EMS), 发芽率仅为 15.5%。 从表 2 中可以看出: 在 EMS 体积分数为 0.1%~0.6%时, 随着体积分数升高,发芽率逐渐降低; 而在 EMS 体积分数为 0.7%和 0.8%时, 发芽率趋于平稳; 半致死剂量出现在 EMS 体积分数为 0.3%处理组样品, 该组出芽率为 47.0%; 临界致死剂量出现在 EMS 体积分数为 0.4%处理组样品, 该组出芽率为 38.0%。
2.2 SRAP 标记鉴定杜梨幼苗的 DNA 变异
利用筛选的 10 对 SRAP 标记通用引物对不同处理组的样本 DNA 进行鉴定, 统计各组幼苗的变异频率。 结果表明: 10 对引物总共检测到 15 个变异位点, 平均每对 1.5 个, 变异位点多出现在 100~500 bp扩增大小区间。 数据统计结果显示, EMS 的体积分数为 0.4%时, 变异频率最高, 为 37.3%(表 2)。 可见, EMS 处理梨种子使其产生了可鉴定的序列位点突变。 如图 1 所示: 为引物 em10-me5 检测对照组与0.4% EMS 处理组随机选取的 20 株幼苗的遗传突变扩增图谱, 可见 0.4%EMS 处理组在 100~250 bp 间产生了突变位点。 通过引物扩增的重复试验, 可以确定检测到的变异位点是稳定可靠的。
2.3 诱变植株的田间生长测量与分析
不同体积分数 EMS 处理后的幼苗定植田间后, 定期管理幼苗, 测量杜梨苗第 1 年和第 2 年停止生长时的植株高度和节间长度, 并计算各组植株高度均值的差异显着性以及平均节间长度(表 3)。 统计结果显示: 杜梨苗第 1 年和第 2 年停止生长时, 植物高度均值最高的组都为对照组, 其高度分别为 81.9cm 和 175.5 cm; 植物高度均值最低组则发生了变化, 第 1 年停止生长时最低组为第 4 组, EMS 体积分数为 0.3%, 其高度为 44.5 cm, 而第 2 年时, 最低组为第 8 组, EMS 体积分数为 0.7%, 其高度为 92.0cm; 杜梨苗第 1 年和第 2 年停止生长时, 各组株高均与对照组差异极显着(P<0.01), 可见 EMS 处理梨种子后都在一定程度上影响了梨苗的生长。 平均节间长度数据的统计结果显示: 杜梨连续 2 a 停止生长时, 对照组的节间长度都是最长的, 分别为 1.97 cm 和 3.10 cm。 第 1 年停止生长时最短组为第 6 组
EMS 体积分数为 0.5%, 其长度为 1.68 cm。 第 2 年时, 最短组为第 5 组, EMS 体积分数为 0.4%, 其长度为 2.56 cm; 第 1 年停止生长时, EMS 处理各组的梨苗节间长度差异不显着; 第 2 年停止生长时, 对照组与第 2, 4, 5, 7, 8, 9 组差异极显着(P<0.01)。
2.4 EMS 处理促进杜梨种子突变的最佳体积分数
诱变育种中一般采用植株半致死剂量或临界剂量作为诱变的最佳体积分数[17]。 杜梨苗的半致死剂量出现在第 4 组, EMS 处理体积分数为 0.3%; 临界剂量出现在第 5 组, EMS 体积分数为 0.4%。 经过SRAP 分子标记检测, 变异频率最高的组为第 5 组, EMS 处理体积分数正好为临界剂量。 在表型数据上, 虽然第 4 组的梨苗高度低于第 5 组, 但 2 组之间的差异并不显着; 而在节间长度方面, 2 组的长度较为接近。 因此, 综合以上数据分析, 确定 EMS 处理促进杜梨种子突变的最佳体积分数为 0.4%。
3 讨论
3.1 EMS 诱变植物产生不同类型的突变
EMS 是一种良好的化学诱变剂, Klmark于 1953 年最早报告了 EMS 对突变诱导的有效性。 其后 EMS被广泛应用于植物中, 其产生的突变类型较多。 例如抗逆类型突变, Zhou 等[5]使用 EMS 诱变水稻, 获得了抗盐性的突变植株; 品质和产量类型突变, Fang 等[8]使用 EMS 诱变花生 Arachis hypogaea, 获得高油酸突变体; 形态特征类型的突变, 这类突变是 EMS 诱变后突变最多的类型, 而且大致上都是以矮化为主, EMS 在许多植物[6-14]上都产生了不同程度的矮化突变体。 本实验中, 使用不同体积分数的 EMS 诱变杜梨种子后, 不仅产生了可检测的遗传变异, 各处理组在株高上显着低于对照组, 形态上发生了变化, 但要确定这些变异是否为可遗传的稳定变异, 还有待于进一步试验研究。
3.2 EMS 诱变植物的最佳体积分数
不同体积分数 EMS 诱变植物产生突变体效率不同。 Fang 等[8]使用 10.0 g·kg-1的 EMS 处理原本油酸含量 44.2%的花生品种, 得到了油酸含量超过 60%的突变体。 而 Zhou 等[5]使用体积分数为 0.5%的 EMS处理水稻种子, 获得了抗盐性较好的突变体。 我们使用不同体积分数的 EMS 处理杜梨种子, 结合分子和生理指标的鉴定, 获得了促进杜梨突变的最适宜 EMS 体积分数为 0.4%。 由此可见, EMS 处理在不同物种的最佳使用体积分数是有差异的, 需要针对不同物种进行优化和筛选。
3.3 EMS 诱变的分子标记鉴定
EMS 是一种烷化剂, 能够诱发基因突变, 多为点突变[4], 使用 DNA 分子标记的方法可以快速有效地鉴定出突变位点。 胡建斌等[18]使用 SRAP 分子标记技术检测到了 EMS 诱变黄瓜 Cucumis sativus 的变异位点。 殷冬梅等[19]使用随机扩增多态性 DNA(RAPD)分子标记技术检测到了 EMS 诱变花生的突变位点。 相比于其他分子标记, SRAP 分子标记的特点: 操作较为简单, 只涉及到 PCR 扩增; 引物片段较长, 重复性较好; 使用通用引物, 正反向引物可以随机组合; 检测结果中共显性标记占标记位点的比例较高[20-21], 在基因组中分布较为均匀, 更适用于检测农艺性状的差异[22]。 本试验中, 使用的 10 对通用SRAP 引物共检测到了 15 个突变位点, 检测效率较高, 可对筛选适宜的 EMS 体积分数提供可靠的数据支持。
3.4 EMS 矮化分子育种中起到重要作用
EMS 在农作物与蔬菜花卉中的应用较广 , 已构建了很多突变体库 。 由于木本植物生长周期较长,获得稳定遗传的时间较长, 所以在果树上的应用研究还比较少。 本研究中, 我们首次使用不同体积分数的 EMS 药剂诱变杜梨种子, 通过分子和生理数据的鉴定与分析, 得到了最佳的诱变处理体积分数, 其种子繁殖当代植株在形态上表现出了一定的变异特征, 相比于传统的杂交育种和自然突变体筛选, 化学诱变的效率更高。 本研究结果将为今后快速获得梨突变体提供可靠的理论基础和依据。
参考文献:
[1] 中华人民共和国农业部. 中国农业年鉴 2012[M]. 沈阳: 辽宁教育出版社, 2012: 214 - 215.
[2] 柴明良, 沈德绪. 中国梨育种的回顾和展望[J]. 果树学报, 2003, 20(5): 379 - 383.
香蕉是我国热带亚热带地区最重要的经济作物之一,但由于叶片大、假茎脆弱、根系浅,容易遭受风害。台风具有持续时间短、破坏程度大的特点,是香蕉生产过程中最主要的自然灾害之一。2014年7月19日登陆广西的强台风威马逊对广西蕉区造成了严重危害。为此,本文...
核桃是一种重要的油料果树,我国的核桃种植数量比较大,核桃的产量约占世界核桃贸易量的20%~25%.核桃是一种落叶乔木,不仅有很高的营养价值,同时也有很大的医用效果,因此当前人们对核桃的种植力度不断加大。因为核桃独特的优势,使得核桃成为生态林和经济...
山葡萄是东北地区的特产,可酿造出优质葡萄酒,深受广大消费者欢迎。山葡萄从建园开始,到进入盛果期,一般需5年左右。目前大面积栽培山葡萄多数采用篱架,少部分为小棚架。山葡萄整形与修剪目的在于调节生长和结果,合理配置枝蔓。1整形山葡萄在东北可以露地越...
核桃是楚雄州主要的经济林栽培树种,枝叶繁茂、根系发达,具有较强的保持水土、净化空气、美化环境的作用。核桃仁营养丰富、风味独特,是人们十分喜爱的食品,并具有多种保健和医疗作用。近年已成为楚雄州山区的主要经济作物和大宗出口商品。1云南地区核桃...
笃斯越桔属于杜鹃花科,越桔属,又称都柿、甸果、地果,为多年生落叶小灌木。笃斯越桔果为蓝黑色小浆果,味酸甜爽口,既可直接食用,又可制成饮料、果酱、糖果和酿酒,而且含有多种氨基酸和维生素,以及越桔精、视紫质等,具有很好的营养保健功效,是黑龙江省宝贵的森...
栖霞有中国苹果之都的称号,近年来,栖霞苹果质量日趋下降,其主要原因是不科学合理施肥,造成土壤养分失衡,土地肥力下降,土壤污染等.腐植酸肥料可改良土壤,促进微生物代谢及繁殖,从而增加土壤有益微生物的保有量,增强微生物的活性,改善土壤微环境,节能降耗,减...
灰枣原产河南省,系国内优良的制干枣品种,近年来在西北地区多有发展,栽培面积逐年增加。但灰枣花量大、花期长,开花期对营养的消耗大,导致落花落果严重,自然坐果率极低,仅为1%~2%.如果技术措施不到位,很容易出现只开花不结果或结果稀少的现象。笔者...
为推广应用该有机肥,发展无公害优质遂川金桔提供科学依据。笔者于2012年在遂川金桔果树生产管理中进行了该肥的肥效试验,现整理初报如下:1供试材料1.1井龙生物有机肥系由遂川县裕龙绿色农业开发有限公司提供。其有效氮、磷、钾总含量5%,有机质含量...
1树体过早衰老机理的探讨衰老是生物自然过程,不可避免。但与猕猴桃先进国家相比,我国猕猴桃(甚至其他果树)提前衰老、结果年限严重缩短却是不争的事实。人为因素对果树衰老、结果年限影响的可能原因如下:1.1不适当地提前结果,一旦结果产量不受控制国...
0、引言冬枣以其味道鲜美,糖分含量多,富含19种人身体所需的氨基酸和维生素、多种微量元素和较多的药用成分等特点,被公认为品质最好的鲜食枣品种,具有很高的食疗价值和多种保健功效,被誉为活维生素丸。中国新疆南疆地区由于常年降雨量在30~60mm左右,平...