兰科植物种子萌发相关因素研究

　　兰科（Orchidaceae）植物是最大且分布最为广泛的有花植物之一，有地生、附生及腐生等多种生态（生境）类型，多数为珍稀濒危植物，具有很高的观赏和药用价值。如天麻、铁皮石斛等为我国传统中药，有些种类如蝴蝶兰、卡特兰等则因其花形、花色千姿百态，绚丽夺目而常用于插花观赏[1-2].兰科植物种子细小如尘，发育不完全，仅具尚未分化的原胚，自然条件下需与合适的菌根真菌共生才能萌发。

　　兰科植物自然生境的破坏和资源的过度开采，加上其极低的自然繁殖率，致使野生资源在原始生境的恢复异常困难，野生兰科植物极度濒危。濒危兰科植物的再生和合理利用有赖于种苗快繁技术的蓬勃发展，而该技术的核心问题之一便是种子萌发。研究兰科植物种子萌发的相关培养条件（温度、光照、培养基组成、共生萌发真菌等）和共生萌发机制（生化、营养、分子等方面）以及种子成熟度、预处理与萌发率的关系，将对兰科植物种苗快繁途径中有性繁殖技术的发展起到促进作用，从而为兰科植物资源的可持续利用提供理论依据。

　　1 种子成熟度与萌发率

　　影响种子室内萌发的因素有水分、氧气、温度、光照、培养基组成及种子成熟度等。

　　种子成熟度是影响种子萌发的关键因素之一。但并不能简单地认为成熟种子的萌发率要高于未成熟种子，因为当种子达到某成熟度之后，种子成熟度的增加将不 再 显 着 提 高 萌 发 率，甚 至 有 可 能 会 降 低 萌 发率[3-6].例如Calanthe tricarinata在授粉150d后形成种子最适宜无菌萌发，因为此时种胚长至最大尺寸，种皮开始脱水，并逐步缩至薄薄的一层；而授粉180d后的种子萌发率明显低于授粉150d后的种子。研究发现，内源性脱落酸浓度随着种子成熟度的增加而增加，而高浓度的脱落酸是公认的阻碍种子萌发的因素，这可能是导致出现该现象的原因之一[7].不同培养条件下，不同成熟度的种子萌发率不同。

　　Spathoglottis plicata人工授粉4~5周和8~9周后形成的种子分别在3种不同培养基上非共生萌发，其中Phytamax（PM）培养基附加2%（w/v）蔗糖及2.0g/L的蛋白胨最适合授粉8~9周后的种子萌发，而添加了1.0mg/L 6-BA的P723培养基最适合授粉4~5周后的种子萌发，但不利于授粉8~9周后的种子萌发[8].播种时种子的成熟度影响着播种培养基的选择和预处理的方式，所以了解种子成熟度与种子萌发之间的关系可为后续播种方案的选择和缩短繁殖周期等提供参考。

　　2 种子收集与预处理

　　2.1种子收集

　　收集和有效保藏种子是实现兰科植物种质资源持续利用的前提。通常的做法是在超净工作台上，先对即将开裂却未开裂的蒴果进行表面消毒（70%~75%乙醇1min,2.5% NaClO 15min），接着用无菌水冲洗数遍，然后用无菌滤纸吸去多余水分，最后用无菌手术刀沿着蒴果腹缝线将其划破，取出种子。乙醇、NaClO的浓度和消毒时间可依据蒴果大小等酌情处理，使用的先后顺序也可视具体情况调节[9-10],其中NaClO可用过氧乙酸或HgCl2代替。

　　2.2种子预处理

　　播种前，对种子进行预处理可以促进萌发，这是因为兰科植物种子种皮中存在着萌发抑制物质（如木质素[11-12]），或种皮本身阻碍了种子对水分和氧气的吸收，所以为了促进萌发，物理上一般采用磁性棒搅拌或超声波法去除种皮对种子萌发的抑制[13],化学上则用NaOH、KOH、NaClO及Ca（ClO）2等溶液来破坏种皮并起到消毒作用。除此之外，有的种子在萌发前需经过后熟作用，所以低温层积也是常用的预处理方法之一[14-15].

　　通过上述处理可显着提高兰科植物种子共生萌发的萌发率，陆生兰（Epipactis palustris）种子即使与适宜的真菌共生萌发，萌发率也非常低，除非对种子进行预处理：用Ca（ClO）2划破外种皮，随后在4~8℃下低温层积8~12周。因为自然条件下，该种子的原地萌发、真菌侵染均发生在初春，它在萌发前需经过后熟作用，且外种皮的部分分解有利于水分吸收和真菌侵染[16].除此之外，低温层积预处理还可促进Platan-thera praeclara、P.leucophaea种子的共生萌发[17-18].对于兰科植物种子的非共生萌发，除可采用上述预处理方法外，还可用适宜浓度配比的激素混合液浸泡处理。如将Calanthe discolor种子放在含有萘乙酸（NAA）1~100mg/L,乙 烯 磷1 000mg/L,6-BA 10mg/L或100mg/L的溶液中浸泡7d后再播种在不含激素的无菌培养基上，发现能促进该种子萌发[19].目前，有关激素促进兰科植物种子萌发的机制尚不清楚。

　　3 非共生萌发

　　兰科种子非共生萌发的培养条件主要包括温度，光照（光源、强度、时间），气压（压强、气体成分及比例），基本培养基及植物激素（植物生长素类、细胞分裂素类及其浓度配比），碳源（蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等），氮源，活性炭的添加，天然有机提取物（马铃薯汁、香蕉汁、椰子汁等），pH值等。

　　3.1温度

　　兰科植物种子的培养温度一般控制在20~30℃,大多数以25℃为宜。一般情况下，兰科植物种子在此温度范围内均能萌发，但每一物种均有其最适温度。

　　例如霍山石斛（Dendrobium huoshanense）种子在26~29℃时的萌发率明显优于24~26℃和18~21℃[20].

　　3.2光照

　　有报道称，兰科植物种子的感光不是必需的而是光促进类型[21].总体而言，兰科植物种子有些需要完全暗培养，而有些需要光暗交替培养，且光照周期因种而异。光照对种子突破种皮这一阶段影响不大，如已萌发至原球茎，必须给予适当的光照，原球茎才能继续发育成幼苗。研究发现：在无菌萌发试验中，完全暗培养一段时间后给予光暗交替培养是春兰（Cymbidiumgoeringii）启动种子萌发所必需的，全光照或全黑暗条件下种子均不萌发[22].此外，Bae等研究了不同光源（蓝光、红光LED）对Oreorchis patens无菌萌发的影响，发现这两种光中，红光LED更适宜此物种的种子萌发[23].

　　3.3气压

　　理论上，培养兰科植物种子的气压条件与它的野外生境越接近越好，这需要不断的探索。研究发现，当气压增至1.8atm时能促进Galeola septentrionalis种子萌发，而此时O2和CO2的最佳浓度分别为5%、8%[24].如条件允许，可深入研究并将其与气候变化相结合。

　　3.4基本培养基及植物激素添加

　　兰科植物种子非共生萌发的基本培养基多为1/2MS、MS、VW、KS、SH、KundsonC、N 6、PT、Hyponex1、Hyponex 2;在碳源方面，蔗糖最好，半乳糖对胚的生长有抑制作用。蔗糖作为培养基中的能源物质和渗透调节剂，对原球茎的生长影响较大，一般在培养基中添加2%~3%.有研究证明，2%的蔗糖有利于兰属原球茎的生长。此外，在培养基中添加活性炭可以有效吸附酚类物质，从而减少褐变[25-27].氮源方面，兰花胚在含有氨盐的培养基上生长良好，它对氨盐的亲和力是与兰花特有的营养习性有关，对某些兰科植物种胚而言，尿素是有效的氮源，但对另一些种来说却具有抑制作用[2].天冬氨酸和精氨酸在培养兰科植物离体胚时，作为培养基中的氮源是非常有效的[28].

　　有些兰科植物种子非共生萌发困难，可以通过添加植物激素在一定程度上来克服，目前常使用的外源激素是生长素类（如IAA、2,4-D和NAA）、细胞分裂素类（如6-BA、ZT和KT）和赤霉素（GA）；激素可单一添加也可配合使用，其中单一添加某种激素时有限的促进效果 暗示了兰科植 物种 子萌发机制 的复杂性[19],而不同类别激素的配合使用往往能有较为明显的促萌发作用。研究发现，较高浓度（1.0mg/L）激动素（KT）与较低浓度（0.1mg/L）NAA的配合使用对佛手参（Gymnadenia conopsea）种子的非共生萌发具有明显的促进作用[29].种子萌发研究初期离不开最适培养基的筛选。王建勤等就曾分别用VW、KC、MS及改良的VW、MS、KC对金线莲（Anoectochilus roxburghii）种子进行无菌萌发，发现种子在KC和改良的MS培养基上萌发率最 高，但KC培 养 基 上 的 原 球 茎 较 早 就 出 现 衰老。[30]

　　3.5天然提取物的添加

　　在种子无菌萌发培养基中添加适宜的天然提取物能促进种子萌发，这一结论已得到众多论证：Pierce等发现，豌豆种子提取物能刺激Ophrys apifera种子的萌发[31];Malabadi等发现，在培养基中添加一定量的烟饱和水能促进Oberonia ensiformis和Xenikophy-ton smeeanum种子的无菌萌发，原因是由于烟饱和水中的丁烯酸内酯能促进种子萌发[32-33].然而，如果培养基中添加了不适宜的天然提取物，不但不会促进萌发，还会起到反作用。如在培养基中添加一定量的马铃薯汁可促进铁皮石斛（D.officinale）种子萌发，而添加香蕉提取物和椰乳则对其有不利影响[34].对某些物种而言，添加激素的促萌发效果不如添加天然提取物。如在Orchis purpurella种子无菌萌发试验中，无论是单独使用激动素（KT）还是和IAA结合使用，都对原球茎的生长和发育有显着的影响，但其促进效果都不如添加马铃薯汁或椰子汁[35].

　　3.6 pH值pH值影响着种子萌发过程中各种合成分解酶的活性，适宜的pH值能提高种子萌发率。

　　pH 5.0~5.8的环境最适宜兰科原球茎的生长，过酸或近中性环境都不适合。Prakash等曾研究了4个梯度的pH（3.5、4.5、5.5和6.5）对Vanda tessellata种子无菌萌发的影响，发现pH=5.5时，萌发效果最好，萌发率最高，在培养30d后，就已经达到60%的萌发率，继续培养至90d,萌发率达到最高值95%左右，而pH=3.5或6.5时，在培养90d后仍没有萌发现象，而在pH=4.5时，培养60d的萌发率才达到20%左右，而在90d时，此pH值下培养的种子全部死亡[36].