辽宁大白菜物种多态性及亲缘关系的聚类分析

　　大白菜 (Brassica Campestris L． ssp． PekinensisOlsson) 隶属于十字花科 (Brassicaceae ) 芸薹属(Brassica) 中的一种叶用蔬菜，是一种具有中国特色的植物，有 “蔬菜之王”的美称，深受人们的喜爱; 它原产地为地中海沿岸和中国，长江以南为主要产区; 由于中国芸薹属植物大白菜的种质资源复杂，以及起源、演化和种类扩散等原因，使中国大白菜个别种类出现同物异名、异物同名的现象，为菜农们对优良品种的选育带来了不便; 此外，个别品种的大白菜由于生长期较长，需要的生长条件较为复杂，在实践中已经被淘汰; 过去的一些地方品种已经被杂交种取代，虽有个别地方种仍在种植，但由于产量低，抗病力差，也逐渐在被淘汰;更有一些地方种在长期的生产实践中要么丢失了、要么已经名存实亡，失去原有的种质特征［1］。所以，为了更能利用现有资源，选育更优良基因品种用于生产实践，具有重要的理论和实践意义。文章对大白菜种类进行亲缘关系分析，运用改进的 CTAB法提取高质量的大白菜基因组 DNA，以 RAPD 分子遗传标记法得出数据，利用 NTsys 2． 10e 软件进行聚类分析，得出七种大白菜的相似系数及树状图［2］。聚类分析是通过数据的形式建模从而简化数据的方法。它分析简单而且直观，主要针对探究性的研究。现今，聚类分析的涉及领域有很多，主要包括数学、统计学、经济学、医疗信息处理和生物学等。目前聚类分析获取了很多优秀成果，如:

　　基因表达序列分析技术。本实验利用的是聚类方法是层次聚类，能够将物种多态性及亲缘关系进行聚类分析，得到其树状图和相似系数。

　　1 材料与方法

　　1． 1 试验材料

　　北京新 3 号; 91 － 12 白菜; 韩国黄心白菜;秋宝白菜; 秋绿 60 白菜; 丰抗 90 白菜; 青杂三号。 (材料来自辽宁省新民市春硕种植专业合作社)
　　
　　1． 2 试验仪器

　　高速冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂，GL－ 20G － IT) ; PCR 仪 (MG96G，杭州朗基科学仪器有限公司) ; 低温冰箱 (青岛海尔股份有限公司，BCD －216TMZL) ; 紫外分光光度计: (T6 新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司) ; 凝胶成像系统、电泳仪器。

　　1． 3 试验药品

　　2% CTAB 提取液; β － 疏基乙醇; 10 × PCRbuffer、DNA Marker、dNTPs、28 条引物、高温 Taq酶、DNA 模板; Nacl; 无水乙醇; 75% 冰乙醇;TE 缓冲液; 液氮等。

　　1． 4 试验方法

　　1． 4． 1 大白菜基因组 DNA 的提取步骤

　　预热1 mL 2% CTAB 缓冲液于1． 5 mL 离心管，预热的条件为 65 ℃，20 min。将七种大白菜幼嫩叶子分别称取2 g 进行液氮研磨。分别放入1． 5 mL的离心管里并加入400 μL 5μL/mL 的 β － 巯基乙醇和预热的 2%CTAB 提取液［2］。将其放入 65 ℃下水浴至少 60 min，用冷冻离心机在 4 ℃ 离心 12 000rmp 10 min［3］。将上述七个离心管离心后去掉上清液，分别加入等体积的氯仿: 异戊醇重复抽提，用冷冻离心机离心，4 ℃离心 12 000 rmp 10 min。将离心过后的上清夜放入另一个同样等大的离心管中并分别加入 75%乙醇 (预冷) ，可出现白色絮状沉淀 (即 DNA ) 。用冷冻离心机在 4 ℃ 离 心12 000rmp 10min。将七个离心管上清液倒出，进行 10 min 的干燥后加入 TE 缓冲液 (100 μg/mL) 。

　　基因组 DNA 溶解完全后向七个离心管中分别加入50 μL / mL RNase (37 ℃ 消化 60 min) 。在七个离心管中加入 400 μL 异丙醇及 1/10 的 100 μL 5 mol/LNaCl 溶液，在低温冰箱中 － 20 ℃ 保温至少 20 min以上。用 75%的乙醇 (预冷) 反复洗涤，充分去除杂质，无水乙醇漂洗 1 次。待提取的大白菜基因组 DNA 风干后，再分别向七个离心管内加入适量TE 缓冲液溶解基因组 DNA，作为 DNA 原液。置于－ 20 ℃ 保存。

　　1． 4． 2 大白菜基因组 DNA 的纯度及完整性检测

　　1． 4． 2． 1 大白菜基因组 DNA 纯度测定

　　将上述的 DNA 原液取其 20 μL，加入 180 μLTE 缓冲液，离心、放在比色皿中，用紫外分光光度计进行比色。以 200 μL TE 缓冲液作为参照，在260 nm 和 280 nm 波长处分别进行比色。 计算A260 / A280 数值，作为基因组 DNA 纯度［4 －7］。

　　1． 4． 2． 2 大白菜基因组 DNA 完整度测定

　　制备 1%琼脂糖凝胶，七种大白菜基因组 DNA样品: EB 按 5∶ 1 的比例。Maker: EB 按 1∶ 1 混合的比例。将其混合液用移液枪打入孔内。电泳: 条件电压 100 V。观察: 将混合样品在凝胶系统下进行观察并记录。

　　1． 4． 3 PCR － RAPD 反应体系的建立

　　有效引物的筛选: 将提取出的七种大白菜基因组 DNA 加入 DNA 池中，用随机 28 条引物分别进行七种大白菜基因组 DNA 的 PCR 扩增，之后进行电泳，凝胶成像系统进行观察，图像中出现条带的片段，所用的引物为有效引物。

　　PCR 扩增的反应体系:反应进行的总体积为 25μL: Taq 酶 2． 5 U/μL; 10 × PCR Buffer; 模板 DNA 50 ng /μL; 28 条引物 (上海生工生物工程公司) 。dNTPs 0． 2 mmol/L 度、Mg2 +1． 5 mmol / L．

　　1． 4． 4 电泳检测:

　　1% 琼脂糖凝胶，5 × TBE 电泳缓冲液。电泳条件: 100 V 电压，在凝胶成像系统下观察、拍照并记录。

　　1． 4． 5 数据分析:

　　RAPD 多态性条带统计: 引物与模板 DNA 互补的结合位点均代表了电泳图谱中的每个条带，即称为一个分子标记; 每次反应重复 3 次，以条带清晰，重复出现 2 次或 2 次以上的条带为记录对象。

　　按照电泳图谱，全部材料再同一位点 RAPD － PCR反应出现电泳条带的记为 1，没有出现电泳条带出现的记为 0，最后以 0/1 矩阵模型在 Excel 表格输入电脑的使用［11 －15］。

　　多态性带比率: 在一个特定的分子标记上，如果电泳条带出现的频率小于 0． 99，那么此条带便视为具有多态性的条带，即多态性带。 (P: 多态性带比率; K: 多态性带; N: 扩增出的总条带数)P = (K / N) × 100%RAPD 相似系数: F: 相似系数; NXY: 两个群体或者两个个体之间共同具有的 RAPD － PCR 分子标记数; NX: X 群体或者个体具有的 RAPD － PCR分子标记数; NY: Y 个体或者群体具有的 RAPD 分子标记数。(出自 Nei 和 Li 的方法)F = 2NXY/ NX+ NY数据分析: 使用软件 NTsys 2． 10e 分析数据，得到相似系数，并绘出聚类图。

　　2 结果分析

　　2． 1 DNA 纯度检测

　　2． 1． 1 DNA 纯度和产量

　　实验采用改进的 CTAB 法，分别对七种大白菜进行基因组 DNA 提取，存于 TE 溶液或者去离子水中，并用紫外分光光度计检测吸光值，上述步骤要重复 3 次，取效果最好的结果进行记录并计算，结果可知 OD260/ OD280 的范畴在 1． 796 ～ 2． 031 之间(如表 1) ，说明提取的七种大白菜基因组 DNA 几乎没有蛋白质杂质污染，其纯度可以满足 RAPD 分析的需求。

　　

　　2． 1． 2 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度

　　通过凝胶成像系统观察七种大白菜基因组DNA 样品 (如图 1 ) ，可看出各种大白菜基因组DNA 样品主带较为清晰，完整性较好，迁移率较低，点样孔中无蛋白质 － DNA 混合物滞留，但具有少量的 RNA 存在。注: (M: Maker; 1: 北京新3 号; 2: 91 － 12 白菜; 3: 韩国黄心白菜; 4: 秋:

　　宝白菜; 5: 秋绿 60 白菜; 6: 丰抗 90 白菜; 7:青杂三号)

　　2． 2 引物筛选

　　实验选取秋宝白菜和丰抗 90 白菜两种具有代表性的白菜为模板，以从上海生物工程有限公司合成的 28 条 S 系列的引物进行筛选，有的随机引物对七种大白菜基因组 DNA 样品均不能产生扩增条带，有的随机引物产生的条带较弱不清晰且只对部分种类产生条带，所以，实验反复 3 次，选用条带清晰，多态性较好且稳定重复的 5 个引物，来进行七种大白菜基因组 DNA 样品的 RAPD 分析。筛选出的引物分别为 S25，S183，S197，S206和 S1026。

　　2． 3 RAPD 反应体系的分析

　　2． 3． 1 大白菜基因组 DNA 扩增条带的多态性分析

　　实验利用所筛选出的 5 条引物，对 7 种大白菜基因组 DNA 样品就行扩增，每条引物均反复扩增三次，选取条带清晰，并稳定重复出现的条带为统计对象。结果表明，5 条引物在七种大白菜基因组DNA 样品中共扩增出 67 条条带清晰且重复性好的DNA 带，其中有 41 条具有多态性，多态性比率为61． 2% ，呈现出较为丰富的多态性。平均每条引物产生13． 4 条 DNA 带，和8． 2 条具有多态性的 DNA带。不同引物扩增出的总带数和多态性带数有明显差异，其中扩增条带数较多的引物分别是 S183和S1025; S1025扩增条带的多态性比率较高 86． 7%，S197扩增条带的多态性比率较低 30． 8% (如表 2) 。

　　

　　扩增图谱如下:

　　2． 4 聚类分析

　　2． 4． 1 相似系数分析

　　使用 NTsys 2． 10e 软件，利用 RAPD － PCR 进行分析所得的数据，进行聚类分析，得到了七种大白菜各样品之间的遗传相似系数，建立 UPGMA 聚类图。遗传相似系数越高，每个样品之间的关系密切。由分析数据可得，七种大白菜的相似系数介于0． 4 ～ 0． 8 之间，即得平均相似系数为 0． 6; 北京新3 号、秋绿 60 白菜和丰抗 90 白菜三种大白菜的亲缘关系较近，可达到 0． 8，由此可推断三者之间可能具有同源性，属同一品种 (如表 3) 。

　　

　　2． 4． 2 树状图分析

　　图 7 为七种大白菜的遗传品种亲缘关系树状图，各样品的相似系数均小于 1，并且 7 种样品又都能聚类在一起，说明个样品之间具有同源性，但是各种间也具有不同程度的差异。由图示，可将七种大白菜划分为两大类，将聚类图在 0． 65 处做结合线，得出第一类分别是 C2: 91 － 12 白菜、C3:

　　韩国黄心白菜、C4: 秋宝白菜和 C7: 青杂三号;将聚类图在 0． 77 处做结合线，得出第二类分别是C1: 北京新 3 号、C5: 秋绿 60 白菜和 C6: 丰抗 90白菜。

　

　　3 结论

　　在该实验中对七种大白菜的纯度及其引物的筛选进行多次反复的重复实验，保证实验结果的准确性及稳定性，最终结果表明提取七种大白菜的OD260 / OD280 的范围在 1． 796 ～ 2． 031 之间，达到进行 RAPD 分析的标准。在 28 条随机引物中 S25，S183，S197，S206和 S1025能够符合大白菜基因组 DNA扩增条带的多态性分析的需求并从实验结果中可以看出: 7 种大白菜基因组 DNA 样品多态性比率为61． 2% ，其中 S183和 S1025; S1025扩增条带的多态性比率的较高，而 S197扩增多态性比率较低。利用RAPD 分子标记进行的遗传相似系数研究中可以看出各类大白菜的遗传相似系数都小于 1，第二类C1: 北京新 3 号、C5: 秋绿 60 白菜和 C6: 丰抗 90白菜亲缘关系较近，可能属于同一品种。而第一类C2: 91 － 12 白菜、C3: 韩国黄心白菜、C4: 秋宝白菜和 C7: 青杂三号多态性遗传差异较大。从研究结果的遗传相似系数可以看出遗传多样性与品种和地域的差异有着一定的关系。

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