微卫星标记在鲟鱼分子遗传学研究中的应用

　　遗传学应用论文（8篇核心期刊范文）之第七篇

　　摘要：鲟科鱼类是世界上最古老的鱼类之一, 具有很高的科研价值及经济价值。介绍了微卫星标记在鲟鱼种群遗传多样性、种质鉴定、亲缘分析与性别鉴定等方面的应用情况。

　　关键词：鲟鱼,微卫星标记,遗传多样性,种质鉴定,亲缘关系

　　鲟科鱼类是起源最早的软骨硬鳞鱼类之一, 素有水中“活化石”之称[1], 其隶属硬鳞总目 (Chondrostei) 、鲟形目 (Acipenseriformes) , 在我国主要分布在长江、黑龙江和新疆额尔齐斯河以及伊利河等区域, 为亚冷水性鱼类[2]。鲟鱼肉鲜味美, 蛋白丰富, 尤其是其具有“黑色黄金”之称鱼子酱, 价格更是居高不下[3]。但由于近年来人为等外界因素破坏, 以及鲟鱼性成熟晚, 世代周期长, 幼鱼成活率低等因素, 使其野生资源量急剧减少, 现已被《中国脊椎动物红色名录》标记为极危或濒危状态[4]。为满足鲟鱼及其鱼子酱市场需求, 我国从上世纪90年代开始了鲟鱼的人工养殖, 人工养殖技术也逐渐成熟, 据《2017年中国渔业统计年鉴》显示, 我国2016年鲟鱼产量已达8.97万吨。虽然鲟鱼养殖业逐渐崛起, 但由于缺乏规范的引种制度和必要的繁殖记录, 后备亲鱼不足, 使得近亲交配严重, 种质现状繁杂, 养殖和野生群体遗传多样性匮乏, 严重制约我国鲟鱼产业的健康发展和野生资源的恢复。因此, 开展鲟鱼分子遗传学研究, 了解鲟鱼种质现状和遗传背景等对其种质保护、良种培育、野生资源保护和恢复具有重要意义。

　　随着分子生物技术的发展, 产生了诸如随机扩增多态DNA标记 (RAPD) 、限制性片段长度多态性标记 (RFLP) 、扩增片段长度多态性标记 (AFLP) 、微卫星标记 (SSR) 和DNA序列测定等技术。微卫星标记又称简单重复序列 (Simple Sequence Repeat, SSR) 标记。微卫星DNA指真核生物基因组中均匀分布着大量由几个碱基 (1-6 bp) 组成的串联重复序列。与其他分子标记相比, 微卫星标记具有共显性、结果稳定可靠、重复性好、可比性高和基因覆盖率广, 标记累计优势明显等特点而被认为是近似理想的遗传标记[5], 在鱼类遗传学研究中发挥着重要的作用。本文就微卫星标记在鲟鱼种群遗传多样性、种质鉴定、亲缘分析与性别鉴定等方面进行综述, 以期为微卫星标记在鲟鱼遗传学研究中的有效应用提供理论依据。

　　1 种群遗传多样性研究

　　遗传多样性是生物多样性重要组成部分, 一般认为是不同群体之间或同一群体内不同个体基因频率上不同造成的遗传变异的总和。根据等位基因频率可以计算群体的遗传多样性指数, 为评估物种种群的种质现状提供理论依据和生产指导。微卫星标记因引物易得, 是共显性的单位点的遗传标记, 位点等位基因数量多且杂合度高[6], 较其它分子标记具更能准确获得群体的基因频率等优势[5], 而在群体遗传多样性研究中发挥着重要的作用。

　　董颖等[7]对采自所房山十渡国家级鲟鱼良种场人工繁殖F2代67尾小体鲟 (Acipenser ruthenus) 进行微卫星遗传多样性分析, 发现该种群存一定程度的近交现象, 警示养殖者注意亲鱼管理并建议通过引进不同来源亲本改善这一情况。孔杰等[8]为了弄清贵州省惠水鲟鱼繁育基地施氏鲟 (A.schrenckii) 后备亲本的种质现状, 利用30对鲟属微卫星标记对32尾施氏鲟亲本进行遗传多样性分析, 发现目前该养殖场施氏鲟群体遗传多样性较为丰富。张书环等[9]对在江苏溆浦段发现的15尾疑似中华鲟 (A.sinensis) 幼鱼进行分析微卫星多样性分析, 发现该批幼鱼遗传多样性略低于野生中华鲟, 暗示中华鲟幼鱼遗传多样性水平降低, 野生亲本的数量仍不容乐观。赵娜[10]对葛洲坝下中华鲟产卵场捕捞的8尾野生中华鲟尾进行微卫星多样性分析, 结果显示该批样本遗传多样性较低。杨瑞[2]利用自主开发的20对达氏鳇 (Huso dauricus) 和21对西伯利亚鲟 (A.baeri Brandt) 微卫星引物对人工养殖达氏鳇和西伯利亚鲟群体进行多样性检测, 发现该两群体存在一定要程度的杂合子过剩现象。提示该两群体较小且封闭, 亲本来源有限[11], 应对现有亲本合理配组、引进不同来源亲本等方法, 避免近交现象, 提高群体遗传多样性水平。辛苗苗[12]利用微卫星标记对3个中华鲟养殖群体进行遗传结构和多样性分析, 结果表明该三个群体遗传分化程度中等, 无近交繁殖现象, 存在一定程度的远交现象, 遗传变异程度高于张四明等[13]连续3年 (1995-1997) 共70尾来源于长江水系中华鲟亲本的研究, 因此建议增加中华鲟养殖种群间的基因交流, 进行人工保种。郭向贺[14]利用12对标记分析施氏鲟、小体鲟、西伯利亚鲟、达氏鳇和俄罗斯鲟 (A.gueldenstaedti) 等5个养殖群体的遗传多样性, 结果表明该5个鲟鱼群体遗传多样性均处于较低水平, 种群内存在一定程度近交现象。

　　2 种质鉴定

　　鱼类的种质鉴定一般包括:不同种间的鉴定、同种不同群体的鉴定、杂种的鉴定等, 鉴定方法多样, 主要有形态学、RAPD、RFLP、AFLP、微卫星、物种特异性PCR等, 选择合适的鉴定方法将决定鉴定的深度和水平[6]。微卫星是共显性遗传, 覆盖范围广、高专一性和多态性, 更能够能准确的计算出所有等位基因的频率, 在种质鉴定特别是种源多的物种鉴定中有着其他方法无可比拟的优势[5]。现存的鲟鱼多为人工养殖, 种源少且复杂, 而鲟鱼都是多倍体鱼类, 疏于管理下的鲟鱼极易进行杂交, 导致种质混乱, 影响鲟鱼产品的品质, 阻碍鲟鱼产业的健康发展, 进行准确的鲟鱼种质鉴定是解决目前鲟鱼种质混乱及提高鲟鱼产业价值的有效途径。

　　吴文化[15]利用13对微卫星标记对11种鲟鱼养殖群体进行品种鉴别, 结果显示有6对标记能在11种鲟鱼中稳定扩增, 且不同种鲟鱼扩增结果存在差异。胡佳等[16]用39对微卫星引物扩增施氏鲟、达氏鳇及其正反交子代基因组, 获得6个特异位点 (HLJSX22、HLJSX23、HLJSX37、HLJSX41、HLJSX48、LS54) , 将位点组合能有效鉴定出这两种鲟鱼及其杂交子代。刘洋等[17]利用28对微卫星引物对施氏鲟、达氏鳇及其杂交子代进行种质鉴定, 发现有5个特异位点 (H LJSX350、H LJSX226、H LJSX329、H LJSX332、H LJSX351) 在三种鲟鱼种扩增出差异显着性条带。张书环等[9]采用11个微卫星位点对江苏溆浦段发现的15幼鲟样本、30中华鲟、39达氏鲟和33施氏鲟进行遗传分析, 发现幼鲟样本和中华鲟遗传距离最近 (Fst=0.039, P<0.05) , 与另外两种鲟鱼遗传距离相对较远, 从遗传学角度判定该批幼鱼为中华鲟。

　　3 亲缘分析与性别鉴定

　　亲缘分析一般是通过生物学、分子遗传及医学理论等方法, 从形态构造、生理机能、遗传物质基础等方面来判断亲代与子代之间的亲缘关系[18]。在亲缘关系鉴定主要的两种方法:基于排除概率排除法和基于似然比的似然法中, 排除法最为常用且简单有效[19]。在现有的鲟鱼养殖中容易出现不同近缘谱系的混养状况, 若能将其区分开, 则能防止近亲繁殖带来的种质衰退等问题, 这对种质保护具有重要意义。目前国内外在这方面的研究报道还较少。朱滨等[20]利用湖鲟 (A.fulvescens Rafinesque) 的4对微卫星引物对中华鲟的亲缘关系进行了初步研究, 其中2对引物表现出较高的多态性, 能够有效区分中华鲟人工放流个体和繁殖个体。Rodzen J A[21]等利用微卫星标记进行了高首鲟 (A.transmontanus) 的亲子鉴定分析, 发现微卫星等位基因作为显性标记的方法可以用来准确的该两种鲟鱼估计该亲子关系和亲缘关系。辛苗苗等[22]利用10对微卫星引物对68个中华鲟个体进行亲子鉴定, 基于排除率不低于99%的标准建立了包括7个微卫星标记 (Asi-75067、Asi-67648、Asi-67123、Asi-73843、Asi-72040、Asi-70421、Asi-56700) 的中华鲟亲子鉴定体系。刘洋[23]筛选了1个特异性标记 (HLJSX350) , 能区分施氏鲟、达氏鳇父母本种群从而确定杂交子代。

　　鲟鱼鱼子酱具有极高的经济价值和营养价值, 因此养殖雌性鲟鱼无疑能带来更大的经济效益, 然而鲟鱼个体大, 性成熟时间长, 从外形上难以辨识其性别, 因此, 进行鲟鱼早期的性别鉴定对鲟鱼产业的发展有着重要的意义。目前利用超声波[24,25]、创伤手术[26]、生理生化[27]等方法鉴定鲟鱼性别的研究已有报道。而利用微卫星标记鉴定鲟鱼性别的报道甚少, 仅见刘洋等[17]筛选出了可能与性别决定位点存在一定连锁关系的6对施氏鲟微卫星标记, 为施氏鲟早期性别鉴定积累了基础数据。

　　4 存在问题与展望

　　从以上例子中可以看到, 微卫星标记已在鲟鱼遗传多样性、种质鉴定和亲权分析等遗传学研究中得到了广泛应用, 为鲟鱼的种质状况, 保种育种和生产管理等方面提供了一定的理论依据。然而微卫星标记应用在鲟鱼早期性别鉴定和数量性状在连锁图上的定位分析 (QTL, Quantitative Traits Loci) 等方面的研究甚少。

　　鲟鱼鱼子酱具有有极高的经济价值和市场需求, 开展鲟鱼早期性别鉴定的研究不仅能为鲟鱼全雌化苗种培育打下基础, 还能节约生产成本, 提高经济产出, 延伸产业链, 增加鲟鱼产业产值, 产生更大的经济效益和社会效益。QTL定位是利用图谱和标记性状进行遗传分析, 其重要的应用之一是根据遗传标记定位控制经济性状的基因, 是鱼类遗传育种工作的一项重要内容, 利用微卫星进行鱼类QTL定位的研究已有大量报道[28], 而有关鲟鱼微卫星标记QTL的研究还是空白, 今后可适当开展QTL的定位获得与某些经济性状紧密相关的微卫星遗传标记, 为鲟鱼育种工作提供理论指导。如能将微卫星标记应用到这些方面上, 必将挖掘出鲟鱼产业更大的生产潜力。

　　参考文献
　　[1]陈曾龙, 罗相忠.世界鲟形目主要种类生物学[J].浙江海洋学院学报 (自然科学版) , 1999 (03) :238-242.
　　[2]杨瑞.养殖达氏鳇和西伯利亚鲟种群微卫星验证及遗传多样性分析[D].大连:大连海洋大学, 2016.
　　[3]郭向贺, 董颖, 胡红霞, 等.鲟鱼种质鉴定方法研究进展[J].生物技术通报, 2014 (02) :56-63.
　　[4]蒋志刚, 江建平, 王跃招, 等.中国脊椎动物红色名录[J].生物多样性, 2016, 24 (05) :501-551+615.
　　[5]孙效文, 张晓锋, 赵莹莹, 等.水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用[J].中国水产科学, 2008 (04) :689-703.