河弧菌的阴性表型分子遗传学基础研究,医学遗传学论文

　　河弧菌 ( Vibrio fluvialis) 是一种新发的食源性致病菌，1975 年首次分离于巴林 1 名腹泻患者粪便中，也曾被称为 F 群弧菌( Group F vibrios) 和 EF －6 弧菌( EF －6 vibrios)。河弧菌自然分布于温暖含盐的水体中，可通过污染海产品、淡水及海水水体得以传播。在人类主要引起急性胃肠炎，临床症状与霍乱很相似，不同的是河弧菌感染的部分患者便中带血;此外也有出血性蜂窝组织炎、脑炎、菌血症及腹膜炎等肠道外感染的报道，曾在孟加拉国、印度等地造成大的暴发流行，美国、日本、中国、约旦、南斯拉夫等国也有河弧菌引起腹泻病例的报道。

　　作为一种嗜盐的革兰阴性兼性厌氧细菌，河弧菌在无盐培养基上一般不能生长或生长不良，在1% ～ 6% 甚至 8% NaCl 培养基上能良好生长。河弧菌的生化表型特征与气单胞菌属相似，API 20E 生化鉴定条的结果常不确定，盐耐受试验有助于区分两者，因为气单胞菌不能在 6% NaCl 培养基上生长。河弧菌与弗尼斯弧菌( V． furnissii) 的差别仅在于其发酵葡萄糖而不产气。精氨酸双水解酶、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶及阿拉伯糖发酵实验常被用作区分河弧菌和霍乱弧菌及其他不凝集弧菌的种特异性鉴定所需的 4 个基础生化指标。河弧菌表现为精氨酸双水解酶阳性、阿拉伯糖发酵阳性、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶阴性。

　　精氨酸双水解酶系统通过 3 个酶促反应将精氨酸经瓜氨酸转变为鸟氨酸、CO2和 NH3。首先在精氨酸脱亚氨酶( arginine deiminase，arcA 编码)的作用下，精氨酸 + H2O 生成瓜氨酸和 NH3; 在鸟氨酸氨基甲酰转移酶 ( ornithinecarbamoyltransferase) 的催化下瓜氨酸 + Pi 生成鸟氨酸和磷酸氨甲酰，最后在氨基甲酸激酶( carbamate kinase) 的作用下磷酸氨甲酰 + ADP 生成 ATP、CO2和 NH3。该系统的编码基因为 arc 操纵子，包括 arcA、arcB、arcC 三个基因分别编码精氨酸脱亚氨酶、鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酸激酶，在不同种的细菌中其组织结构和排列方式有所不同，如在猪链球菌( Streptococcus suis) 中为arcABC 结构，而在弗尼斯弧菌中为 arcBCA 结构。我们在前期工作中发现 1 株精氨酸双水解酶阴性的河弧菌 Ma －2531，本研究进一步探索了决定该阴性表型的分子遗传学基础。

　　1 材料方法

　　1. 1 菌株来源及鉴定
　　菌株 Ma － 2531 分离自马鞍山1 例腹泻患者粪便标本，EF85003 分离自新疆1例腹泻患者粪便标本。API 20E 生化鉴定条和针对河弧菌 toxR 基因保守序列及 16S ～ 23S rDNA 间隔序列的 2 对特异性引物 toxR-F/toxR-R和VFLU-F / VFLU-R鉴定为河弧菌，标准菌株CICC21612 购自中国食品药品检定研究院( NIFDC) ，作为阳性对照。

　　1. 2 试剂和仪器
　　聚合酶链反应( PCR) 扩增特异性引物由上海生工生物技术有限公司合成，PCR 扩增的酶及相应试剂，DL5000 Marker 购自大连宝生物工程有限公司; API 20E 生化鉴定条为法国bioMérieuxsa 公司产品，精氨酸双水解酶生化鉴定管( 073130 和 0713140) 购自广东环凯。PCR 扩增仪为 MJ 公司的 PTC200，凝胶成像仪为 Bio-Rad GelDoc XR 系统。酶联检测仪为奥地利 Tecan 的Infinite M200 Pro。pH 计为德国 Mettler Toledo 的FiveEasy。

　　1. 3 PCR 检测
　　1. 3. 1 引物种特异性鉴定引物参照文献进行，精氨酸双水解酶代谢基因簇检测引物根据弗尼斯弧菌 NCTC 11218 的基因组序列和河弧菌相关序列 KC569550通过软件 Oligo 6. 0设计，序列见表 1。【表1】
论文摘要

　　1. 3. 2 模板制备菌株划线接种于 LB 琼脂平板，37 ℃ 培养过夜，次日用灭菌牙签挑取单菌落于60 μl灭菌去离子水中，煮沸 10 min 后冰浴 10 min，12 000 r / min离心 5 min，取上清作为 PCR 扩增的模板。

　　1. 3. 3 扩增参数 94 ℃ 预变性 5 min，94 ℃ 30 s，55 ～ 60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 33 个循环; 最后72 ℃ 延伸 10 min。

　　1. 3. 4 琼脂糖凝胶电泳 1 g 琼脂糖加 100 ml0. 5 × TBE，煮沸溶解，冷却至 58 ℃ 左右，加 5 μl 核酸染料 GoldView，混匀后制胶。PCR 产物取 5 μl 上样电泳，Bio-Rad Gel Doc XR 系统读取图像。

　　1. 4 精氨酸双水解酶生化表型检测
　　挑取 Ma －2531 和 EF85003 的新鲜菌落分别接种于 LB 37 ℃振荡培养 18 h，用吸管吸取 2 滴上述菌悬液加入西林瓶内( 开启西林瓶前，用 75% 酒精棉球消毒西林瓶表面，无菌条件撕开铝盖后打开西林瓶胶塞) ，加灭菌液体石蜡 8 滴覆盖培养基表面，培养 18 ～24 h后观测结果。每株被检菌同时接种试验管和对照管各 1 支。结果判定标准: 阳性为试验管呈蓝绿色，对照管呈黄色; 阴性为试验管与对照管均呈黄色。

　　1. 5 生长曲线和 pH 值的测定
　　将 Ma － 2531 和EF85003 的新鲜菌落分别接种于 LB 中 37 ℃ 振荡培养过夜，次日按1∶ 500的比例加入 100 ml LB 液体培养基中，按时间间隔测其生长曲线和 pH 值的变化。

　　酸耐受试验中将 LB 培养液用浓盐酸调至 pH 5. 40，同上接种过夜培养物，培养 8 h 和 24 h 后测定培养液的 pH 值变化。
　　
　　2 结果

　　2. 1 精氨酸双水解酶表型 API 20E 生化鉴定条显示菌株 EF85003 精氨酸双水解酶阳性，而 Ma －2531 精氨酸双水解酶阴性，鉴于精氨酸双水解酶阳性为河弧菌的特征性鉴定指标之一，API 20E 表型结果易受菌株生长等多因素的影响，加之文献中也未有精氨酸双水解酶阴性的河弧菌株报道，我们用精氨酸双水解酶生化鉴定管进行了进一步的验证，以 EF85003 为阳性对照，证实 Ma － 2531 的精氨酸双水解酶阴性，见图 1。【图1略】

　　2. 2 精氨酸双水解酶通路相关基因的检测河弧菌与弗尼斯弧菌非常近源，二者精氨酸双水解酶表型一致，根据其全基因组序列和河弧菌序列KC569550，我们设计不同的引物组合对 Ma － 2531 进行 arc 相关基因的检测，各引物相对位置见图 2。【图2.图3略】

论文摘要
　　
　　针对 arcBCA 编码基因的引物对 arc-F/arc-R、arc-F / arc-rev 和 arc-ck-up / arc-R 对 Ma － 2531 的扩增结果均为阴性，对照菌株均给出预期大小的特异性扩增条带，说明 arcBCA 基因簇在 Ma －2531 中的缺失。笔者针对 arc 操纵子两侧的序列设计了引物arc1-up / arc1-dn 和 arc72695-up / arc75219-dn 进行扩增，结果 Ma －2531 扩增出和对照菌株一致的条带，说明存在相关序列，然后分别以 arc1-dn 和arc72695-up 的反向互补序列作为上下游引物 arc1-dnRev 及 arc72695-upRev 对 Ma － 2531 进行扩增，获得 1500 bp 的扩增条带，测序分析表明，该扩增片段包含 transposase IS4 的序列和 argR 5'部分序列及arcD 基因后间隔区的部分序列。该结果证实在菌株 Ma － 2531 中由于 transposase IS4 的插入导致了包括精氨酸双水解酶系统 arcBCA 基因簇及上游的天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基和催化亚基编码基因在内的约 8. 6 kb 大片段的缺失，从而导致Ma － 2531精氨酸双水解酶阴性的生化表型。

　　2. 3 生长曲线和 pH 值的测定文献报道链球菌和嗜水气单胞菌的精氨酸双水解酶系统有助于细菌细胞对酸性环境的抗性，通过水解精氨酸产生NH3，逆转酸性的不良生长环境。为此，笔者比较了精氨酸双水解酶系统阴性和阳性菌株 Ma －2531 及 EF85003 在液体 LB 中 pH 值和生长曲线变化( 图 4 ～5) ，从图中可看出无论是生长曲线，还是正常( pH 7. 0) 及酸性( pH 5. 4) 培养条件下的 pH 值变化，二者均呈现相同的趋势，说明精氨酸双水解酶系统的缺失不影响 Ma －2531 的生长和对酸性环境的抵抗，提示在河弧菌中可能存在其他的代偿机制能抵御培养液的酸化，但也不能排除 2 株菌株遗传背景差异所带来的影响。【图4-5】
论文摘要
　　
　　3 讨论

　　精氨酸双水解酶又称精氨酸脱亚氨酶( argininedihydrolase) 、瓜氨酸亚氨酶 ( citrulline iminase) 、或精氨酸脱亚氨酶( L-arginine deiminase) ，是弧菌科细菌鉴别的重要生化指标之一。河弧菌精氨酸双水解酶一般为阳性，而精氨酸双水解酶阴性河弧菌的出现增加了通过生化表型实验来鉴定河弧菌的难度和不确定性，由 transposase IS4 插入导致的精氨酸双水解酶阴性的河弧菌为首次报道。鉴于转座子的可移动性，不排除其在自然界或感染宿主体内环境中在不同菌株间转移，从而造成新的表型特征菌株的出现。细菌通过精氨酸双水解酶系统水解精氨酸作为能量来源，在猪链球菌中该系统还被认为是一潜在的毒力因子，有助于菌株对酸性环境中的抵抗，提升生物适应性。本研究中也比较了精氨酸双水解酶系统正常和缺失的 2 株菌的生长曲线和培养液 pH 值变化，没有发现差别，除菌株遗传背景差异的影响外，实验中选择 LB 这种富营养的培养液可能也起了屏蔽作用，在后续研究中笔者拟使用低营养成分培养基( minimal medium) 和人工构建精氨酸双水解酶系统缺失的菌株，在相同遗传背景下进一步研究精氨酸双水解酶系统在河弧菌的致病和环境生存中的生理意义。