同源重组修复和合成致死的重要研究进展

　　DNA 双 链 断 裂（DNA double strands breakage, DSB）是细胞受到电离辐射后生物学上最严重的损伤。

　　DNA 损伤激活细胞内 DNA 损伤应答（DNA damageresponse,DDR），产生细胞凋亡、细胞周期阻滞以及DNA 损伤修复等一系列生物学效应。DSB 修复有同源重组（Homologous recombination,HR）和非同源重组末端连接（Non-homologous end-joining,NHEJ）修复两种方式。本文着重介绍 HR 修复分子机制、影响因素、合成致死及其与 NHEJ 修复的关系，并探讨其临床应用的潜在可行性。

　　DNA 损伤启动多种修复机制，其中 HR 修复是保护基因组完整性的重要机制，参与 DNA 单链断裂（Single strand breakage,SSB）导致的复制叉断裂和链间交联以及 DSB 的修复，以姐妹染色单体为 DNA 模板，是无错误修复通路，只发生在 S 期和 G2 期[1].放射生物学家们从 20 世纪早期已着手 HR 修复与 DSB的关系的研究，本文仅以时间点为线索回顾 HR 修复和合成致死的重要研究进展，详见图 1.
　　
　　1 同源重组修复机制、影响因素及其合成致死效应

　　HR 修复的主要成分包括 MRN（MRE11–RAD50–NBS1）复合体，RAD51、RAD51 同源异构体、RAD52（在酵母菌中）、RAD54,涉及 BRCA1、CtIP（CtBPinteracting protein）、ATM、ATR、PALB2（Partner andlocalizer of BRCA2）、BRIP1（BRCA1 interacting proteinC-terminal helicase 1）等因子[1-2].

　　1.1 HR 修复机制 HR 修复分为 3 个时期：（1）联会前期；（2）联会期；（3）联会后期[1-3].

　　1.1.1 联会前期 MRN 复合体与 DNA 断端结合启动HR 修复，Mre11 与 CtIP 启动 5'-3‘切除过程[4].核酸外切酶 1 和具有解螺旋酶 - 核酸内切酶功能的 STR-Dna2 复合体共同作用持续产生 ssDNA.RPA 覆盖切除的 DNA 断端，限制二级结构形成，促进 RAD52 介导的重组酶 RAD51 装载。RAD51 在 ssDNA 上形成前联会核蛋白纤维[1,3].

　　1.1.2 联会期 RAD51-ssDNA 联会前核蛋白纤维介导同源序列的寻找和 DNA 链侵入，这是 HR 修复核心反应。靶 DNA 与 RAD51 核蛋白纤维之间的 DNA 链配对形成 D-loop,包括新异源双链 DNA 和供体 DNA 移位的链[3].RAD54 协助 RAD51 寻找 DNA 同源序列、Holliday 联结分支的迁移及 RAD51 取代侵入 DNA 和启动 DNA 修复的过程[5].

　　1.1.3 联会后期 以 3'- 断端为引物进行 DNA 合成，RAD51 与 dsDNA 分离，暴露 DNA 合成所需的 3'-OH[1].第二个 DSB 断端与扩展的 D-loop 平行，形成双Holliday 联结，在解离酶作用下这些对称结构产生交换型或非交换型产物[3].

　　1.2 HR 修 复 的 影 响 因 素 HR 修 复 受 RAD51、BRCA1、BRCA2 等因子调控。BRCA1 的肿瘤抑制因子活性依赖其细胞周期检查点、转录、蛋白泛素化、凋亡和 DNA 修复方面的功能，受 BRCT 磷酸蛋白识别区域调节。Rad50、RAD51 和 γH2AX 的募集过程依赖 BRCA1,BRCA1 缺失细胞丧失使 RAD51 集中于DNA 损伤区域的能力，导致 HR 和 NHEJ 修复、S 期和 G2-M 期细胞周期检查点均存在缺陷[5-6].间 质 - 上 皮 转 型（Mesenchymal epithelialtransition,MET）抑制剂下调 MET 活性，减少 RAD51移入细胞核并阻断 RAD51-BRCA2 复合体之间相互作用，致 HR 修复受损，γH2AX 消退延迟，细胞内DSB 持续高水平[7].CDK1、2（Cyclin dependent kinase1,2）磷酸化 BRCA2,调节其与 RAD51 相互作用，促进 S/G2 期 HR 修复[8].

　　总之，HR 修复是众多因子共同作用相互协调的过程，这些因子失活或步骤中断都会对 HR 修复的最终效应产生影响。

　　1.3 合成致死 合成致死（Synthetic lethality）指 2 个或以上基因同时突变的遗传组合导致细胞死亡，而这些基因中任意一个基因突变都不会引起细胞死亡。HR修复缺陷肿瘤细胞中常见 BRCA1 和 BRCA2 等基因突变，此背景下应用特异性靶向药物抑制特定基因表达，产生合成致死效应。其治疗策略意义是在 DNA 损伤修复缺陷肿瘤细胞中抑制其他修复通路促进合成致死效应；也可抑制预先存在细胞周期检查点缺陷或修复缺陷细胞的细胞周期检查点，增加损伤 DNA 聚集和促进细胞死亡[9].

　　2 HR修复与NHEJ修复的关系

　　对 IR 所致的 DSB HR 与 NHEJ 修复具有互补作用。一个决定修复方式的重要因素是 5'-3'DNA 断端切除，启动 NHEJ 修复失败后进行，促进 HR 修复而非经典 NHEJ 修复。53BP1 阻断断端切除抑制 HR修复，是关键调节因子[10].DDR 因子 E3 泛素连接酶 RNF168 促进删除 BRCA1 的细胞中 H2A/H2AX 在K13/15 单泛素化和 53BP1 聚集在损伤区域，抑制 HR修复[11].HR 修复缺陷细胞中，易产生错误的 NHEJ修复是主要修复方式，染色体易位和重组的频率增加。

　　G2 期两条通路均有效时，优先选择不易产生错误的HR 修复[12].

　　3 HR修复研究的潜在临床意义

　　DSB 修复异常作为肿瘤发病风险、预后指标和治疗靶点，近年来受到广泛关注和研究。

　　3.1 HR 修复与疾病发生和预后的关系 BRCA1 N端 RING 结构域和 C 端 BRCT 结构域的遗传性变异对易导致遗传性乳腺癌和卵巢癌[13].BRCA1 特定位点错义突变或氨基酸置换影响 HR 修复和 SSA（single-strand annealing）修复，是遗传性乳腺癌致病因素[14].

　　BRCA1 与 50%~85% 乳腺癌和 15%~45% 卵巢癌发病风险相关。BRCA2 是启动 BRCA1-BRCA2-HR 损伤修复的效应器，其遗传性缺陷与 40%~60% 乳腺癌和10%~20% 卵巢癌终生风险相关[15].

　　部 分 HR 修 复 通 路 因 子 如 PALB、BRIP1、BARD1、MUS81、RAD51 等，有抑制肿瘤活性的功能，在抑制乳腺癌和卵巢癌发病中起主要作用[16].RAD51低表达见于乳腺癌，高表达见于胰腺癌。MRE11（T）11 重复序列突变见于 80% 以上结直肠癌患者中[2].

　　RAD51 家族成员 XRCC2 缺陷时细胞内 HR 修复降低 100 倍，XRCC2 rs3218408 与乳腺癌患病风险相关，rs3218536 与乳腺癌和胰腺癌不良预后相关[17].

　　非小细胞肺癌中 RAD51 G135C 可作为预测临床效果的生物指标，携带 C 等位基因患者中位生存率更高；且在吸烟和既往吸烟患者中，携带 C 等位基因患者总生存率较 GG 基因型患者高[18].

　　3.2 HR 修复与肿瘤靶向治疗的研究进展

　　3.2.1 合成致死的临床应用 HR 修复应用于肿瘤靶向治疗的一个重要机制是合成致死，常见策略有 2 种：（1）以特定 DNA 修复通路为靶点；（2）细胞周期检查点抑制剂。

　　多 聚 二 磷 酸 腺 苷 核 糖 聚 合 酶 [Poly（adenosinediphosphate（ADP）-ribose）polymerase,PARP] 抑制剂是重要的合成致死靶向药物。PARP 在修复 SSB 中的作用是合成致死的基础。复制叉遇到 SSB,该损伤转换为 DSB,NHEJ 不能修复此类只有一个断端的 DSB,需启动 HR 修复；若 HR 缺陷，则无法修复。PARP 抑制剂（PARP inhibitor,PARPi）增加开放型 SSB,致复制相关 DSB 数量增加，最终引起染色单体断裂和细胞死亡[9].BRCA 变异细胞对 PARPi 敏感性是野生型细胞的 1000 倍，PARPi 奥拉帕尼治疗乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌显示出显着疗效[5].但 50% 上皮性卵巢癌 HR 修复完整，限制 PARPi 的应用。17-AAG将 HR 修复完整肿瘤转变为 HR 修复缺陷肿瘤，增加上皮性卵巢癌细胞对奥拉帕尼的敏感性[19].PARPiVeliparib 在三阴乳腺癌和化疗抗拒的卵巢癌前临床试验中显示单药活性[2].Rad52 促进 Rad51 介导的 HR修复，BRCA1、PALB2、BRCA2 缺陷人肿瘤细胞中删除 RAD52HR 修复速度减缓，染色体异常增加，克隆存活率降低，它们之间存在合成致死关系。以 Rad52为靶点的药物研发处于前临床试验阶段[20].

　　应用细胞周期检查点抑制剂于 DNA 修复缺陷细胞是另一种治疗策略。抑癌基因 p53 为调控 G1/S 期检查点所必需，多种肿瘤细胞中失活，尤其是 BRCA1 或BRCA2 突变肿瘤细胞中。ATM-ATR-CHK1 通路参与DNA 损伤后 S 和 G2 期检查点调控，CHK1 抑制剂增加 p53 突变细胞对放射治疗或化学治疗敏感性[9].

　　3.2.2 以 HR 修复通路因子为靶点的肿瘤治疗 HR修复通路主要因子作为肿瘤靶向治疗的潜在靶点已被广泛研究。近年来出现部分以 HR 修复为靶点的抗肿瘤新药，如：（1）蛋白酶抑制剂；（2）Bcl-abl 抑制剂伊马替尼；（3）组蛋白乙酰化酶抑制剂（Histonedeacetylase inhibitors,HDACi）；（4） 热 休 克 蛋 白HSP90 抑制剂 17-AAG.

　　特异性抑制剂改变或降低 HR 修复通路主要因子功能或活性，抑制其修复能力以增加肿瘤细胞对导致DSB 敏感性的目的，此种治疗策略已见于前临床试验。

　　地西他滨处理多发性骨髓细胞激活 DDR,促进 RAD51和 53BP1 形成，联合 RAD51 抑制剂 B02 增加其诱导的细胞凋亡；小剂量 HDACi JNJ-26481585 干扰 DNA损伤修复通路，提高地西他滨介导的细胞毒性[21].

　　MRN 抑制剂 Mirin 阻止 G2/M 期检查点激活和 HR 修复[2].ATM 属 于 PIKK 超 家 族，G1-S 期 ATM S367,S1893,和 S1981 位点脱磷酸化下调 ATM 水平，抑制HR 修复[22],其高度特异性小分子 ATP 竞争性抑制剂KU-55933 提高肿瘤细胞对放射线和致 DSB 药物的敏感性，提示该药的潜在临床应用价值[2].

　　删除特定基因抑制 HR 修复，增加肿瘤细胞放射敏感性，这是具有应用前景的增加放射治疗敏感性的靶点。研究显示敲除 IGF-1R 致 HR 修复缺陷，γH2AX 消除延迟，G1 期细胞放射敏感性增加[23].黏连 蛋 白（Cohesin） 由 SMC1、SMC3 和 Rad21 组 成，磷酸化后激活，DSB 形成时聚集并促进修复。敲除53BP1、H2AX 和 MDC 基因后，SMC1、SMC3 的磷酸化减少；敲除 Rad21 引起细胞周期分布改变，G1 期细胞较 S 期、G2 期、M 期多[24].

　　总之，DSB 是细胞受到电离辐射后发生的最严重DNA 损伤，其修复机制复杂且与肿瘤发病和治疗密切相关。近年来关于其修复机制研究一直是肿瘤转化医学研究的热点，其中 HR 修复作为保护基因组完整性的重要机制受到越来越多的关注，主要集中于 3 个方面：（1）HR 修复基因缺陷与多种肿瘤发病相关，如何筛查携带这些突变基因的高危人群达到预防肿瘤的目的是肿瘤预防的难点，如何检测肿瘤患者中这些突变基因以期制定合理的治疗策略；（2）通过抑制肿瘤细胞 HR 修复通路特别是合成致死，增加肿瘤放化疗敏感性，为肿瘤的靶向治疗提出了一种新的思路；（3）DNA 损伤修复涉及多种修复机制，深入研究它们之间的联系，促进其在肿瘤治疗的应用研究。深入了解 DSB 与 HR 修复之间的分子机制并将其应用于肿瘤个体化治疗有望突破肿瘤治疗成功的瓶颈。