人组织激肽释放酶10在恶性肿瘤的表达和临床实践综述,临床诊断学论文

论文摘要

　　人组织激肽释放酶10(Kallikrein10，KLK10)又称正常上皮细胞特异性基因1(normal epithelial cell-specific1gene，NES1)，是KLK家族新发现的肿瘤相关基因，其异常表达与多种肿瘤发生关系密切，最早发现于乳腺癌，近年研究证实，KLK10在睾丸癌和前列腺癌、肝癌、非小细胞肺癌中表达降低，但在卵巢癌、胃、结直肠癌中显示表达升高。目前尚无基因缺失、突变引起KLK10表达异常的报道。

　　KLK10低表达与甲基化修饰密切相关，但去甲基化不能充分解释KLK10高表达现象。KLK10表达还受类固醇激素调控，多种miRNAs也参与KLK10转录后调控。在部分恶性肿瘤中，KLK10异常表达与KLK基因家族部分成员之间还存在平行关系。

　　本文对KLK10在恶性肿瘤的表达及临床应用进行综述。

　　1 KLK10的基因定位与蛋白功能

　　KLK10位于人染色体19q13．4，长约5．5kb。由6个外显子与5个内含子构成。KLK10存在3种可变剪接(variant1、2、3)和39个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism SNP)位点。KLK10编码激肽释放酶10(hK10)，hK10是一种由276个氨基酸组成、分子量为30kD的分泌型丝氨酸蛋白酶。hK10氨基酸序列不仅与丝氨酸蛋白酶家族之间同源性很强，而且具有丝氨酸蛋白酶的重要结构，但尚未发现KLK10具有丝氨酸蛋白酶的功能。hK10作为细胞质蛋白，在多种组织(乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、胃肠道、唾液腺、胆道、胆囊、甲状腺等)和体液(乳汁、精液、血清、羊水等)中均有表达。KLK10一方面受转录水平的表达调控，另一方面多种丝氨酸蛋白激酶也可能参与KLK10酶活性的激活与失活调节。动物实验中发现，痒刺激可诱导大鼠颌下腺中KLK10及KLK家族其他基因的表达增高。hK10生理功能不明确，可能参与正常细胞的生长、细胞凋亡、血管生成等过程。

　　2 KLK10表达的调控机制

　　2．1 KLK10甲基化

　　表观遗传变异如甲基化、组蛋白修饰参与KLK基因家族的表达调控。甲基化的KLKs也可作为一种潜在的标志物用于恶性肿瘤的诊断与预后评估。KLK10低表达的肿瘤广泛存在第三外显子的甲基化现象。Li等发现，乳腺癌中KLK10基因低表达的主要原因是第三外显子的甲基化。基因序列分析发现，在第二至四外显子处存在富含CpG岛的区域，第三外显子中G+C含量达到69．61%。甲基特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)法发现在乳腺癌的细胞系(MDA-MB-231，MDA-MB-453，MDA-MB-435，MCF-7，Siha，HeLa)中，KLK10第三外显子存在不同程度的肿瘤特异性甲基化且低表达。5-Aza-dC处理后，各细胞系KLK10均获得不同程度重新表达。Kioulafa等进一步证实，KLK10甲基化可以作为早期乳腺癌预后的生化指标。HuangW等利用原位杂交技术发现，在慢性胃炎、高分化、中等分化和低分化胃癌组织中，NES1表达随着胃癌恶性度增高逐渐减少至缺失。在表达减弱或缺失的11例早期胃癌中，10例发现第三外显子的甲基化。5-Aza-Dc可诱导NES1重新表达。

　　Zhang等发现，KLK10是非小细胞肺癌的一种抑癌基因，甲基化是导致KLK10转录失活的重要原因。去甲基化处理后，体外癌细胞系增殖和转移能力被抑制，体内致癌能力减弱。在肝细胞癌细胞系和组织中也发现甲基化引起的KLK10基因和OXGR1基因表达降低。向J7细胞系中转染载体分别为pcDNA-DEST40和pEGFP-N1两种基因的重组质粒，Western blotting结果显示KLK10和OXGR1蛋白表达均增高，同时癌细胞的成簇生长能力减弱。在急性淋巴细胞白血病(ALL)中KLK10/NES1被认为是一种抑癌基因，其在ALL中因高度甲基化而被沉默。甲基化修饰引起的基因沉默机制已被详细揭示不再赘述。值得注意的是，虽然KLK10甲基化可以合理的解释部分恶性肿瘤中KLK10表达的下调。但是在结直肠癌、卵巢癌中，去甲基化作用并不能合理的解释KLK10表达的上调现象。

　　2．2 激素调控KLK10表达

　　KLK10的表达受性激素等类固醇类激素的调控。Lu等发现:雌激素受体(ER)阳性的乳腺癌细胞株BT-474，T-47D，MCF-7中，KLK10可被17獯贫肌岫庳和⒓谆才低煌潭壬系鳎系鞒潭雌激素＞雄激素＞孕激素。地塞米松、醛固酮也可稍增加KLK10的表达;无类固醇激素受体或激素受体阳性的卵巢癌(HTB-75，OVCAR-3)和前列腺癌(LNCaP)细胞系中，KLK10表达并不受类固醇激素的调节;类固醇类激素通过类固醇激素受体复合物和激素调控元件的直接作用调控KLK10的表达;KLK10激素调控元件不在启动子区域，可能位于非编码区和外显子。Kulasingam等发现，人乳腺癌细胞系MCF-10A，MDA-MB-468和T-47D中KLK10的调控受糖皮质激素受体(glucocorticoid re-ceptor，GR)调控。增加糖皮质激素的浓度，MDA-MB-468和T-47D中KLK10的表达上调，但在MCF-10A中表达下调。阻断糖皮质激素受体对三种细胞系中GR的激发和抑制作用也不全相同。乳腺癌中KLK10存在某种糖皮质激素受体的调控机制。Zeng等发现KLK10启动子上存在RARE1、RARE2、RARE3三个类维生素A的反应元件(Retinoic Acid Response Element)。其中，RARE1的突变会导致该启动子报告基因的功能感应丧失。类固醇激素、糖皮质激素可通过与其受体结合后形成激素受体复合物，后者作用于KLK10上游和(或)下游激素反应元件，直接或者间接的调控KLK10的表达。不同的是，KLK10启动子区域并不存在类固醇激素作用元件，而存在三类维生素A反应元件。另外，由于多数KLK基因家族成员均自端粒向着丝粒方向进行转录，KLK10与家族其他成员在部分肿瘤中还存在平行表达，提示类固醇激素调节KLK基因家族在同一个调节位点上。

　　2．3 miRNA与KLK10表达

　　White等发现，卵巢癌中，let-7f、miR-224和mR-516a三种miRNA可与KLK10mRNA3'非编码区(3'UTR)结合，它们不仅与肿瘤的发生密切相关，而且在卵巢癌中也有不同程度的异常表达。NMAWhite向OVCAR-3(无let-7f表达)细胞中分别转染let-7f、pMIR-KLK10和let-7f+pMIR-KLK10，荧光素酶检测结果发现，同时转染let-7f和pMIR-KLK10组与对照组(pMIR+let-7f、pMIR-KLK10、pMIR-KLK10+随机miR、pMIR-KLK10+let-7f+抗let7f)比较信号减弱，细胞增殖被抑制。在OVCAR-5细胞中，let-7f也显着抑制KLK10的表达(蛋白质和mR-NA)，抑制作用与剂量正相关。miR-224或miR-516a对KLK10表达也有一定的抑制作用。虽然let-7f对其他靶基因(如KLK1、KLK6等)的表达也有不同程度的抑制作用。但可以确定的是，KLK10是miRNA调控卵巢癌细胞增殖的下游靶基因之一。

　　在前列腺癌中有多种miRNAs参与KLK10表达调控，其中miR-21对前列腺癌中KLK10的靶向性作用最强。前列腺癌患者组织中，miR-21表达也增高。前列腺癌中KLK10低表达可能与miR-21的抑制作用有关。前列腺癌中miRNA与KLK家族之间存在复杂的关系网。KLK10和其他KLK家族成员也可能存在共同的miRNA调控通路。这一通路称为miRNA-Kallikrein轴。miRNA通过调控KLK基因表达抑制癌细胞增殖的作用，有希望提供一种新的治疗手段应用于临床。

　　3 K LK10在恶性肿瘤中的表达

　　3．1 卵巢癌

　　KLK10在卵巢癌中高表达，血清hK10是卵巢癌的独立的不良的预后指标，KLK10与CA125联合可以增加卵巢癌早期诊断的敏感性和特异性。在早期(Ⅰ，Ⅱ期)卵巢癌中，血清hK10增加了CA125诊断的特异性(90%)和敏感性(20%)。Rosen等发现:296例卵巢癌患者中，CA125无(或低)表达的65例患者均有KLK10、KLK6、OPN和Claudin3的表达，KLK10增加了CA125诊断的敏感性。CA125在炎症反应及子宫内膜异位症患者中也有不同程度的增高。研究证实，KLK6、KLK10和CA125三者中，CA125和KLK10分别是卵巢癌诊断敏感性和特异性最高的标记物。在卵巢浆液性肿瘤中也发现，KLK10-MMP7复合体可增加CA125诊断特异性(96．0%-98．7%)。因此，CA125-KLK10在卵巢癌特别是早期卵巢癌的诊断中有重要意义。有研究探讨了术前血清hK5-8、hK10、hK11、hK13、uPA及抑制剂PAI-1浓度对根治性手术后患者无进展生存期(progressionfreesurviv-al，PFS)、总生存率(overallsurvival，OS)的影响，发现术前血清hK10对患者术后PFS和OS的评估在连续变量和多因素分析中并无统计学意义。在对41例卵巢囊肿和83例卵巢癌患者的生存分析中发现，术前患者组织中生物学标记物KLK10、KLK6、CA125、D-dimer、vWF等与年龄(＞60岁)共同预示生存期在1-3年的患者预后不良，但当患者生存期超过5年时，KLK10与生存期无相关性。

　　3．2 乳腺癌

　　KLK10最早在乳腺癌中被发现，KLK10在乳腺癌中的表达明显下调，KLK10甲基化是早期乳腺癌预后评价的潜在生物学指标。KLK10还可用于指导三苯氧胺(tamoxifen，TAM)对乳腺癌的个体化治疗。甲基化修饰是诱导KLK10在乳腺癌中表达降低的机制之一。利用MSP法在乳腺癌细胞系中发现:KLK10低表达的细胞系(MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-453，MDA-MB-435，Siha)第三外显子中广泛存在甲基化修饰。5-Aza-Dc去甲基化处理后KLK10均重新获得表达，其中MDA-MB-231，MDA-MB-435，Siha与剂量正相关。KLK10的表达缺失和甲基化之间有很强的相关性。但KLK10尚不能作为乳腺癌的诊断和预后评估的独立指标。

　　Kioulafa等探究了KLK10甲基化在乳腺癌患者预后评估中的意义。93例患者中，KLK10甲基化的复发19例(19/53，35．8%);KLK10未甲基化的复发仅5例(5/40，12．5%)。死亡患者中，KLK10甲基化的患者9例(9/19，47．3%)。乳腺癌患者在应用三氧苯胺治疗，子宫内膜癌的发生率增高2～3倍。乳腺癌个体化治疗方面，hK10可以作为乳腺癌患者对TAM治疗耐药的独立的指标。

　　3．3 宫颈癌及子宫内膜癌

　　在子宫内膜癌中KLK10表达在mRNA水平增高但在蛋白水平的表达尚无定论。在宫颈癌中，在宫颈癌上皮组织44例、宫颈CINII-III组织12例、正常宫颈组织10例中利用免疫组织化学方法检测hK10的表达，发现在宫颈上皮内瘤变(CINⅡ-Ⅲ)、宫颈癌患者宫颈组织中KLK10蛋白表达明显高于正常宫颈组织。但KLK10能否作为一种新的生物学标记物用于宫颈癌及子宫内膜癌的诊断和预后评估尚需大量临床研究证实。

　　3．4 前列腺癌及睾丸癌

　　KLK10在前列腺癌细胞系(LNCaP、PC-3)中表达下调甚至缺失。MSP法和5-Aza-Dc诱导KLK10重新表达证实，甲基化是KLK10表达降低的机制之一。White等发现睾丸癌中KLK10的表达受miRNA的调节。在调节KLK10表达的6种miRNA中，miR-21对前列腺癌中KLK10的靶向性作用最强。在前列腺癌患者组织中，miR-21表达也增高。前列腺癌中KLK10低表达可能与miR-21的抑制作用有关。Luo等发现KLK10在正常睾丸组织中高表达，在睾丸癌中表达下调，且随着肿瘤分化程度的下降，表达水平逐渐下降甚至不表达。LuoLY等认为，KLK10是睾丸癌的一种潜在抑癌基因。KLK10在前列腺癌和睾丸癌的临床应用中尚无研究报道。

　　3．5 胃癌及结直肠癌

　　KLK家族多种基因均参与胃肠道恶性肿瘤的进展过程。Huang在胃癌细胞系HGC-27、MKN-45、SGC-7901，AGS，MKN-28中发现，NES1(KLK10)mRNA的表达减少甚至丢失。原位杂交结果显示，NES1-mRNA的表达水平随恶性度增高逐渐减弱至缺失。KLK10甲基化是表达下调的机制之一。但Feng等在36例胃癌患者组织样本中，实时PCR和WesternBlotting结果显示，KLK10表达明显高于癌旁正常组织。KLK10的表达和胃癌浸润深度、临床分期和Lauren分型也密切相关。在胃癌中NES1降低而KLK10表达增高。

　　Alexopoulou等在190例结直肠癌组织中证实，KLK10是结直肠癌的一个新的独立的不利的预后指标。KLK10在结直肠癌中高表达的机制尚不明确。Talieri等发现，在结直肠癌细胞系HT29、LS180、HCT116、DLD1中KLK10高表达。正常组织(10/63，15．9%)、腺瘤(7/12，58．3%)、结直肠癌患者(50/119，42%)KLK10高表达。KLK10表达与淋巴转移、肿瘤分级、DUKE分期和预后密切相关。Feng在63例结直肠癌组织中利用序列分析证实，未发现KLK10存在体细胞突变;第三外显子的第50为密码子有GCC(Ala)-TCC(Ser)的单核苷酸多态性(SNP)位点;第4外显子有4个SNP位点，但仅149位密码子有氨基酸改变(Pro-Leu);第6外显子无SNP位点，但在其上游的内含子中(4779位)，Thy普遍被Cyt替代。KLK家族基因中已知的SNPs已经被证实与恶性肿瘤、高血压和心血管疾病等有关。但由于样本例数较少，尚不能确定上述SNPs与结直肠癌之间存在相关性。

　　4 KLK10在恶性肿瘤诊治中的应用价值

　　KLK10与恶性肿瘤的研究主要在诊断及预后评估中。在卵巢癌中，血清hK10是独立的不良的预后指标，KLK10与CA125联合可以增加卵巢癌早期诊断的敏感性和特异性。在乳腺癌中，KLK10甲基化是早期乳腺癌预后评价的新的生物学指标，KLK10还可作为三苯氧胺选择性用药的指标在乳腺癌的个体化治疗发挥作用。KLK10在非生殖系统肿瘤的防治中也有重要意义。结直肠癌中KLK10mRNA表达有可能用于早期诊断;非小细胞肺癌中KLK10甲基化也是一个候选的生化指标。KLK10调节机制复杂，其与该家族其他成员之间可能存在共同的激素和miRNA调节通路。miRNA-KLK10是否可以作为恶性肿瘤治疗的一个新靶点尚未得到证实。多种针对KLK基因家族基因的靶向药物已经被研发，但尚未得到大量的临床试验证实。

　　5 结语

　　肿瘤的早期诊断和靶向性治疗对提高肿瘤患者生存率具有重要意义。KLK10作为一种新的肿瘤生物学标记物在部分肿瘤中可以作为早期诊断的指标，与其他生物学标记物联合诊断可提高诊断的特异性和敏感性。KLK10及KLK家族酶活性特异性抑制剂可能作为新的靶向治疗药物应用于临床。进一步揭示KLK10异常表达的分子机制也将为KLK10在恶性肿瘤的诊断、预后评估以及治疗等方面提供分子生物学的依据。