胰腺癌miRNA早期检测方法探究,临床诊断学论文

　　2012年《中国肿瘤登记年报》显示目前我国肿瘤发病率为 285.91/10万。其中，胰腺癌恶性度极高，预后差，死亡率接近 100%,在我国恶性肿瘤死亡率中排第 6位，占全部癌症的4.54%.由于胰腺位于腹腔深部，其癌症早期的临床症状通常不明显，大多数患者发现时已处于中晚期，并且超过 95%的患者死于病理诊断后的 5年内。当前上海市胰腺癌发病率正持续上升，总发病率为 12.2/10万，已达到高发国家水平。胰腺癌早期诊断困难与肿瘤的形成过程、诊断方法的局限性以及标志物的选择有很大关系。

　　分子诊断学是近年来发展的新临床诊断方法，主要是对 DNA、RNA 和蛋白质的检测。

　　miRNA近来受到很多专家学者的关注，目前已发现的人类 miRNA共有 1048种（SangermiRBase数据库 20.0版），其数量之多，调节表达功能各异。并已有研究表明 miRNA在胰腺癌中异常表达，是早期发生事件，可反映胰腺癌发生、发展及病理分级，这使 miRNA可以作为新的生物标志物用于胰腺癌的早期诊断.但由于 miRNA序列较短，同源 miRNA相似度高，所以对于其检测敏感性和特异性等方面都提出新的挑战。本文综述了胰腺癌当前临床诊断方法及诊断标志物，并对用于胰腺癌 miRNA早期检测方法进行了探究。

　　一、当前胰腺癌诊断方法及局限性
　　
　　胰腺癌常规诊断方法有病史、查体、病理形态学诊断和影像学诊断等。病史和查体只能大概了解患者情况，而病理形态学诊断是确诊的唯一依据。影像学诊断方法主要有超声诊断、计算机断层扫描成像、核磁共振成像、经内镜超声扫描、内镜下逆行胰胆管造影以及磁共振胆胰管成像等.超声诊断价格低且没有射线辐射的危险，是目前胰腺癌诊断的重要方法之一，但易受肠胀气、腹水和患者体型等影响，对病灶 <2cm的胰腺病变检出率低；计算机断层扫描成像是胰腺癌疑似病例首选的影像学检查方法,与超声诊断相比，计算机断层扫描成像能更清楚的显示肿瘤大小、形态及与周围组织、血管的关系，能更好地判断有无血管侵犯，但其诊断的敏感性与病灶体积密切相关，对于 <2cm的病灶显示有较大的局限性，对早期胰腺癌的诊断意义不大；磁共振胆胰管成像可以了解肿瘤侵及范围，提供全面的胰胆管解剖图像，判断胰管梗阻程度，进行肿瘤术前分期和评价，具有无创、可对角度观察等优点，但显像较粗糙，对早期仅一期胰管形态细微变化的小胰癌的发现有一定的局限性;内镜下逆行胰胆管造影通过收集胰液或对胰管进行细胞学检查，其诊断准确度高，但属于有创检查，创伤性较大，且操作复杂，插管失败率较高，不宜作为首选检查方法;经内镜超声扫描能够通过内镜直接观察黏膜病变，诊断结果优于其它的影像诊断方法，然而该诊断是将探头插入消化管内，并不适合早期筛查.

　　影像学诊断方法是临床肿瘤诊断的常规方法，但是影像设备由于其自身的种种缺陷，通常都是几种技术联合使用，并且由于其诊断敏感性低和特异性不高而多用于诊断高危人群，不能达到早期检测的目的。

　　二、胰腺癌诊断标志物
　　
　　2009年美国临床肿瘤学会（AmericanSocietyofClinicalOncology,ASCO）提出了-些新的胰腺癌检测标志物.蛋白类主要有糖类抗原 199（carbohydrateantigen199,CA199）、PAM4、可溶性 C3b、Dupan2及 Span1等；DNA类有 Kras;RNA类有唾液转录组标记物和 miRNA等。但直到今天，临床上用于胰腺癌患者的诊断、复发以及预后的指标仍然只有 CA199.它是一种糖类肿瘤相关抗原，能够为单克隆抗体 1116NS1999所识别。CA199脏器特异性不强，可能存在于正常人的胰腺、胆道、胃、肠等组织中，在多种肿瘤中如胰腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、胆囊癌、肺癌以及乳腺癌中都可能有不同程度的升高。因此已经有许多学者认为血清 CA199检测并不能准确地鉴别肝胆胰疾病的良恶性，目前 ASCO也不再提倡将其作为用于肝胆胰恶性肿瘤诊断和确诊依据。诊断标志物的缺乏使很多研究人员正致力于寻求新的、特异性强的诊断标志物。

　　三、胰腺癌新型分子标志物 miRNA及其检测方法
　　
　　1.miRNA与胰腺癌 miRNA具有广泛的基因调节功能，据统计 miRNA调节了人类 30%基因，参与了一系列生命活动，包括细胞增殖及凋亡、器官形成、造血过程、发育进程等，与肿瘤的发生、诊断、治疗和预后等有着密切关系，成为肿瘤研究的新热点。它相比于蛋白质等标志物表达异常出现的更早，对早期诊断更加有利。且 miRNA很小，则能有效避免被内源和外源体液降解，因此miRNA相比于 DNA和 mRNA更加稳定。不同种类的肿瘤具有不同的 miRNA表达谱，胰腺癌组织和血液中异常表达的 miRNA具有细胞类型和疾病特异性，提示这些 miRNA可以作为胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物.大量研究发现 miRNA与胰腺癌发生、发展相关，其中表达上调的有miRNA7d、miRNA15b、miRNA18a、miRNA21、miRNA31、miRNA93、miRNA100、miRNA103、miRNA107、miRNA204、miRNA221、miRNA196a等；表达下调的有 miRNA155、let7、miRNA139、hsamiRNA96、hsamiRNA27、hsamiRNA148b、hsamiRNA216、hsamiRNA375等。miRNA与胰腺癌发病相关的、最常见表达异常的癌基因是 Kras和 CyclinD1,抑癌基因是 p53、p21、p16、p27和SMAD4/DPC4.miRNA通过与靶 mRNA的 3′UTR结合来发挥生物学效应。因此，若从已知的靶基因和预测的潜在靶基因中对 miRNA的表达进行干预，可以达到早期预防的效果。进一步明确胰腺癌发生、发展的分子生物学机制，某些miRNA有可能作为治疗胰腺癌的目标靶分子。

　　抗 miRNA寡核苷酸类物质通过与致癌的 miRNA互补，能够特异性抑制肿瘤组织中 miRNAs的活性。此外，人为提高抑癌作用的 miRNAs,如 miR217,可能会对肿瘤的治疗有益.

　　2.用于胰腺癌早期诊断的 miRNA检测方法在胰腺癌的早期检测中，除了标志物的选择和样本等的确定之外，检测方法也是提高检测特异性和敏感性很重要的一个方面。成熟 miRNA片段小，没有 poly（A）尾巴，家族成员间通常只有一两个碱基的差别，并且在细胞中的表达水平普遍较低，从而为 miRNA检测建立带来了困难和挑战。科学家一直在探索可实现 miRNA定量灵敏检测的新方法，如 Northernblotting、微阵列芯片原位杂交技术、定量聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）、滚环扩增法等。这些方法主要分为 2类,一类是无需样本扩增基于探针直接杂交技术的检测方法；另一类是基于样本扩增反应的检测方法。

　　Northernblotting方法是一种直接检测的半定量方法，不需要对 miRNA样本进行预扩增，如Wang等应用 Northernblotting技术分析了let7i、miR22、miR143、miR29b在胰腺癌组织细胞 BxPC1、Capan2和 Panc1中的作用机制；以及Weiss等用同样的方法探究了 miR10a对于促进胰腺癌细胞转移的机制；虽然 Northernboltting是当前 miRNA分析的标准方法，但其缺点是操作繁琐、耗时长、敏感性低，需要样本量过多等，且对RNase污染非常敏感。微列阵芯片是实现 miRNA表达谱分析和多种 miRNA高通量同时检测的主要技术，Volinia等应用 miRNA微阵列芯片技术研究了包括胰腺癌在内的 6种肿瘤，监测了228种 miRNAs的表达情况，结果发现有 137种miRNAs可以很好地区别肿瘤组织来源；该方法的优越性在于可实现高通量、多组分同时检测，但微阵列芯片的制作和检测费用很高，芯片上可利用的样本体积很小，导致敏感性不高，获得数据偏差较大。原位杂交是用比色或荧光试剂等标记的核酸探针与细胞或组织中的 miRNA进行杂交，通过显色或荧光成像检测 miRNA的表达，可直观地展现 miRNA的时空表达模式，如 Obernosterer等设计了用地高辛标记的锁核酸探针，此方法成功应用于多种组织和细胞内 miRNA原位分析，也提高了 miRNA 的检测敏感性；然而由于miRNA序列较短，原位杂交技术需进一步改进，以提高杂交的亲和性，避免 miRNA在杂交及随后的洗脱过程中丢失。滚环扩增法模仿生物体唤醒DNA分子滚环式复制的方式，以循环实现 DNA的连续扩增，Yao等设计了 5′端磷酸化特异性引物，实时定量检测鼠组织中 5种 miRNA表达，该方法可区分组织 let7中 8种 miRNA,线性范围可达到 7个数量级，并且 let7在胰腺癌中是明显表达下调的，结果提示其有望成为胰腺癌早期检测的分子标志物；但以 miRNA为模板连接探针成环的效率低、特异性较差，需要电泳分离后利用放射性同位素检测。定量 PCR是高敏感性定量检测 miRNA的主要方法，反转录 PCR检测是先把miRNA反转录成 cDNA,然后再以 cDNA为模板进行 PCR扩增。目前主要的荧光定量 PCR方法有荧光染料法和水解探针法。常用荧光染料分子式 SYBRGreenI,如 Raymond等首先利用其荧光定量，分析了 12种组织样本中的 6种 miRNA;Jiang等用 SYBRGreenI的 PCR方法定量了人体胰腺、肺等组织中 222种 miRNA前体，并建立了一个在人类癌细胞株中的 miRNA前体表达数据库。SYBRGreenI的优势在于使用方便，不需设计复杂的荧光，也使检测方法变得简单，同时降低成本，但是它对 PCR有一定的抑制性，并且荧光强度较低，稳定性差。水解探针以 TaqMan探针为代表，Lee等利用 TaqMan探针分析了包括胰腺在内的多种人体组织细胞及肿瘤中多种miRNA表达谱，并对 225种前体 miRNA和成熟miRNA的表达谱进行比较。Jiang等用同样的方法来区分几乎完全相同的 let7亚型家族成员。

　　TaqMan探针的出现解决了荧光染料非特异性的特点，反应结束不需进行熔解曲线分析，缩短实验时间，但是其价格高，且只适合于一个特定目标，不便普及应用。此外 TaqMan探针两侧的荧光基团与淬灭基团相距较近，淬灭不彻底使其本底高。

　　由于成熟的 miRNA分子只有 20个碱基左右，序列较短，不能直接用 PCR实现扩增反应，开发miRNA新型检测方法是当前研究者的重点。

　　分子信标检测技术是在上述两大类 miRNA检测方法上发展的一种新型荧光定量技术,弥补了样本量需求大和步骤繁琐的缺陷，并且具有敏感性高、特异性强和可实时监测等优点,是能够实现对 miRNA进行简便快速检测的新方法。

　　目前已有许多尝试将分子信标技术用于 miRNA检测的研究。如 miRNA21已被发现是一种具有高致癌性的 miRNA,也是目前发现唯一在多种实体肿瘤及非实体肿瘤中高表达的 miRNA.Baker等通过分子信标探针对成熟 miRNA21和miRNA21前体进行检测，研究结果表明分子信标可以区分成熟 miRNA21和 miRNA21前体，实现了 miRNA的体外定量检测，因而有可能成为临床样本中成熟 miRNA21和 miRNA21前体评估的有力工具。Yin等将 LNA（LockedNucleicAcid）分子信标作为探针，利用电化学的方法开发出了针对 miRNA21序列检测的高敏感性生物传感器，提高了分子信标检测的敏感性，并且解决了miRNA21不稳定性和低丰度的难题。Stanford大学的 Utz等开发了一种用于 miRNA分型的新方法，该方法采用等速电泳与分子信标相杂交的技术，其优点是便宜、简单、不需要扩增，只需要很少量样本（100ng量级），有望取代 miRNA检测常用的 PCR或 NorthernBlotting方法。Yao等把 miRNA155作为非小细胞肺癌诊断标志物，设计合成了 miRNA155分子信标，利用激光共聚焦显微镜和体视显微镜成像系统实现对 miRNA155的快速检测。

　　四、展望
　　
　　综上所述，胰腺癌恶性度高、预后差、死亡率高，临床通常依靠影像检测，所用诊断试剂盒特异性、准确性低，使其早期发现、鉴别诊断困难。鉴于 miRNA可以反映胰腺癌的发生、发展及病理分级，并且其表达稳定无个体差异，可长期稳定存在，符合人们对于理想分子标志物的要求，可作为胰腺癌分子诊断标志物用于胰腺癌早期诊断。

　　miRNA的检测对于胰腺癌的分子诊断具有重要意义，其分析方法正在不断发展，通过结合新的分析技术和新的探针材料，研究开发高通量、高敏感性、强特异性的 miRNA检测方法，进而实现胰腺癌早期筛检诊断试剂盒的应用。

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