研究植物胞吞途径的主要方法和技术,植物学论文

　　真核细胞中大分子物质和部分信号分子的跨膜传递是通过生物膜包被的囊泡而实现。在物质转运过程中,内膜系统包裹新合成物质或者细胞内循环物质,通过囊泡将其转运至细胞表面,通过与细胞质膜融合将内含物释放到胞外,同时扩展细胞质膜,这一过程被称为胞吐作用 ( Exocytosis) ; 而胞吞作用( Endocytosis) 是指细胞质膜包裹从胞外空间摄取的液体或颗粒物质,质膜内陷,脂双层融合、断裂,最后形成细胞内的独立小泡,将物质转运到细胞内不同靶位点的过程[1,2]。因此,胞吞作用从形态学上可以被认为是胞吐作用的反义过程。胞吞和胞吐作用严格控制了细胞与外界环境的交流过程,为维持细胞自身的物质和能量稳态提供了有力的保障。近年来,胞吞作用因其参与众多的生物学过程而得到了广泛的研究,譬如免疫系统的抗原呈递、外界养分的摄取、凋亡细胞的清除、病原体的入侵、胞外信号的跨膜转导等[3,4]。

　　与动物细胞和酵母相比,植物细胞胞吞途径的研究相对滞后。早期的研究者认为植物细胞中不存在胞吞过程,其主要原因在于植物细胞存在较高膨压,不利于质膜内陷[5 ~8]。但随后的研究中,Saxton和 Gradmann 研究小组首次指出,植物细胞中 < 0. 5MPa 的膨压不会影响胞吞过程的发生[9,10]。除此之外,原生质体胞吞过程和保卫细胞中网格蛋白( clathrin) 包被小泡的发现,证明了胞吞过程也存在于植物细胞中[11 ~13]。在过去的几十年里,大量的研究结果表明,植物囊泡转运途径在植物生长发育及其与各种环境因子互作等方面都具有重要作用。其中,极性定位的生长素运输蛋白 PINs ( PIN-FORMED) 、富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶( leucine rich repeat-receptor like kineses, LRR-RLKs) 均通过胞吞途径进入细胞[14 ~ 16]。另外,番茄中乙烯诱导的木聚糖酶受体 ( ethylene inducingxylanse receptor,EIX2) 、极性定位的拟南芥硼转运蛋白 ( boron transporter,BOR1) 以及铁转运蛋白( iron transporter 1,IRT1) 等转运蛋白运输途径的揭示,有力地证明了植物中胞吞作用行使着重要的生理功能[17 ~19]。

　　根据细胞生物学和电生理学的研究结果,动物细胞中胞吞途径可分为网格蛋白介导的胞吞途径( clathrin-mediated endocytosis,CME) 和不依赖于网格蛋白的胞吞途径 ( clathrin-independentendocytosis,CIE) 。其中 CIE 途径主要包括脂筏介导的胞吞( raft-mediated endocytosis,RME) 、ADP -核糖基化因子 6 ( ADP-ribosylation factor 6,ARF6)介导的胞吞和巨胞饮 ( Macropinocytosis)[3,20,21]。脂筏与毒素、免疫抗原以及信号受体的胞吞途径密切相关,因此 RME 途径也受到研究者的广泛关注[22]。

　　与动物细胞胞吞途径相比,植物细胞胞吞途径的研究一直缺乏合适的货物分子 ( cargo) 。Dhonukshe等 2007 年首次报道,PIN 的胞吞依赖于 Clathrin,这一发现揭开了 CME 在植物细胞中的研究序幕[14]。

　　最近几年的研究发现,CME 也是植物细胞中占有主导地位的胞吞途径。另外,研究者们也发现了植物细胞中不依赖网格蛋白的胞吞途径,其中包括质膜微区标记蛋白 AtFlot1 参与介导的胞吞途径[23,24]。

　　本文将主要介绍网格蛋白介导的胞吞途径以及质膜微区标记蛋白 AtFlot1 参与介导的胞吞途径,并着重总结研究植物胞吞途径的常用方法和技术,譬如药理学分析、拟南芥突变体的应用、生物化学方法以及成像技术等。

　　1 植物细胞中主要的胞吞途径

　　1. 1 网格蛋白介导的胞吞途径 ( clathrin-mediatedendocytosis,CME)

　　CME 主要是指网格蛋白包被的胞吞囊泡介导胞外物质内化的过程,在植物形态建成、组成型摄取调节和细胞质膜蛋白循环的过程中具有重要作用。另外,CME 对于植物生长素的极性运输、营养物质摄取、激素和病原菌入侵诱导的信号转导,以及其它细胞内生命过程 ( 如胞质分裂中细胞板的形成) 都是至关重要的[25,26]。

　　植物细胞中整个 CME 的过程主要由以下几个步骤组成: CME 在细胞质膜启动,招募货物蛋白并形成网格蛋白包被小窝 ( clathrin-coated pits,CCP) ,随后 CCP 成熟,从细胞质膜上断裂并形成网格蛋白包被小泡 ( clathrin coated vesicles,CCV) 。之后几秒钟内,CCV 脱包被,与早期内涵体 ( earlyendosome,EE) 相融合,在 EE 中货物蛋白进行分选,或者进入其他途径[27]。

　　植物细胞中参与 CME 的主要蛋白组分有网格蛋白复合体、衔接蛋白复合体、动力蛋白和其他一些调节蛋白 ( 表 1)[28]。网格蛋白是一个通过自我组装形成的六聚体,由三条重链和三条轻链形成三脚结构,从细胞质内被招募至早期囊泡形成部位。拟南芥基因组网格蛋白家族共有五个成员,分别编码网格蛋白重链 ( clathrin heavy chain,CHC) 的 CHC1和 CHC2 以及网格蛋白轻链 ( clathrin light chain,CLC ) 的 CLC1,CLC2 和 CLC3。衔接蛋白 ( adaptor,AP) 复合体在 CME 过程中负责招募货物蛋白,并与细胞质膜、网格蛋白以及其他调节蛋白相互作用。

　　动物细胞和植物细胞中衔接蛋白家族都由五个成员组成,分别为 AP1、AP2、AP3、AP4 和 AP5,其中 AP2主要参与网格蛋白介导的胞吞途径,并起到中枢作用。动力蛋白 ( Dynamins) 是一类参与细胞质膜上CCV 剪切过程的 GTPase[29 ~31]
,在 CME 过程中,动力蛋白被招募至 CCV,并在 CCV 的颈部形成螺旋状结构,通过水解 GTP 来促进 CCV 与细胞质膜的分离[32,33]。另外,一系列调节蛋白也参与各种货物蛋白通过 CME 进行胞吞。譬如,在根细胞中,生长素可以通过 ABP1 介导的调节途径 ( AUXIN BINDINGPROTEIN 1-mediated regulatory pathway) 来负调节PIN1 和 PIN2 的 CME 过程。尽管 ABP1 蛋白结构中存在 KDEL 的内质网驻留基序,但一部分 ABP1 从内质网逃逸至细胞质膜,在生长素缺失的条件下促进 PIN 蛋白的胞吞[34]。Song 等在研究细胞分裂时发现,通常定位于细胞板的 AtECA1、AtECA2 和AtECA4 也存在于非分裂细胞的细胞膜以及内涵体中。随后 GST Pull-down 和免疫印迹实验的结果表明,AtECA1 可以结合网格蛋白的重链,这些结果暗示 AtECA1、AtECA2 和 AtECA4 可能作为接头蛋白参与调节 CME 过程[35]。

　　CME 在植物细胞中具有着重要的生理功能,然而 Bandmann 研究小组在研究烟草 BY-2 悬浮细胞系的 CME 过程时发现,CME 过程的抑制剂斑鸠霉素 ( Ikarugamycin) 只能部分抑制玻璃粉的胞吞,但是抑制剂渥曼青霉素 ( Wortmannin) 却能显着抑制玻璃粉的胞吞,暗示植物中还存在不依赖网格蛋白的胞吞途径[23]。

　　1. 2 质膜微区参与介导的胞吞途径

　　自从 1972 年 Singer 和 Nicolson 提出生物膜的流动镶嵌模型以来[49],生物膜的研究已经取得了飞速发展。近年来,质膜微区概念的提出,能够更加清楚地解释生物膜上高度动态的、具有特殊理化性质和生物学活性的膜结构。研究植物质膜微区的经典方法是通过从细胞膜中获得耐去垢剂抽提的膜组分( detergent-resistant membrane,DRM) ,并对 DRM 的成分进行分析。结果发现,DRM 中富含固醇 ( 约占40% ) 、鞘脂 ( 约占 20% ) 以及糖基磷脂酰肌醇( glycosylphosphatidylinositol, GPI ) 锚定蛋白。

　　Borner 等从拟南芥愈伤组织中获得了 DRM 组分,并鉴定到一系列富集于 DRM 组分中的功能蛋白,包括 8 个 GPI 锚定蛋白,数个膜定位的 H+-ATPase 以及质膜微区标记蛋白,譬如 prohibitin/ stomatin/hypersensitive response 结构域蛋白等[50]。进一步研究发现,这些富含胆固醇和鞘脂的区域具有多种生物学功能,例如,参与信号转导过程[51]、细胞骨架的动态组装[52,53]、细胞凋亡[54,55]以及胞吞胞吐[2,56]。

　　【1】

　　小窝蛋白 caveolin 是目前为止研究最为清楚的质膜微区标记蛋白,它在哺乳动物细胞中能够介导质膜微区形成小窝结构,从而参与胞吞途径[2]。另外有研究报道,膜筏标记蛋白 Flotillin 在巨噬细胞的吞噬作用中发挥着重要作用[57]
。此外,Glebov 等发现Flotillin1 在哺乳动物中参与介导了一种不依赖于网格蛋白和小窝蛋白的胞吞途径[58]。

　　植物细胞中关于质膜微区的研究相对较晚,目前有关植物细胞中质膜微区的研究主要集中在对一些蛋白和脂类成分的分析鉴定上,而缺乏对其功能和分子机制的研究。2005 年 Borner 等首次鉴定了一个质膜微区标记蛋白 Flotillin 同源物———AtFlot1[50]。Li 等[24]通过高压冷冻固定和透射电镜观测到,AtFlot1 蛋白参与囊泡形成的过程。此外,该研究小组借助荧光共定位研究和免疫胶体金双标记实验发现,AtFlot1 蛋白与网格蛋白的分布是独立的,暗示该蛋白参与介导一种不依赖于网格蛋白的胞吞途径。最后,该小组利用 RNAi 技术降低了AtFlot1 表达水平,结果发现转基因株系显示出生长变慢,株型变小的表型。这一结果暗示,这种生长缺陷的表型很可能是由于质膜蛋白循环受到了抑制,造成了转基因株系中茎尖生长点减小,根分生区长度变短。该项研究不仅阐明了质膜微区在植物细胞胞吞过程中的作用机制,也为进一步揭示植物细胞中质膜微区作用的分子机理提供了理论依据。

　　2 研究植物胞吞途径的主要方法和技术

　　2. 1 药理学分析

　　药理学分析能够特异地阻断物质跨膜和胞内转运的某条特定途径,因而被广泛应用于遗传学实验结果的验证[59]( 表 2) 。布雷非德菌素 A ( BrefeldinA,BFA) 是一种目前研究得较为透彻的药物抑制剂,是鸟嘌呤核苷酸交换因子的敏感型抑制剂,可以阻碍植物细胞中的分泌途径以及囊泡循环转运的过程[60 ~62],而且在网格蛋白和质膜微区介导的胞吞途径研究中均得到了广泛的应用 ( 图 1) 。除此之外,网格蛋白和质膜微区介导的胞吞途径也各有其特异的抑制剂。譬如,酪氨酸磷酸化抑制剂 TyrphostinA23 ( TyrA23) 能够特异性抑制货物蛋白的胞吞基序与 AP2 衔接蛋白复合物 μ2 亚基的相互作用,从而抑制货物蛋白通过网格蛋白介导的方式胞吞[62]。

　　在植物细胞胞吞途径的研究中,TyrA23 已经被用作网格蛋白介导的胞吞途径的抑制剂[63]( 图 1) 。Dhonukshe 等利用 TyrA23 来处理拟南芥根时,发现TyrA23 能够抑制 PIN2 的胞吞[14]。在拟南芥原生质体中,异源表达的人类转铁蛋白 ( humantransferrin receptor,hTfR) 的胞吞也可以被 TyrA23所抑制[64]。此外,渥曼青霉素可以通过诱导细胞质膜上网格蛋白包被小泡的聚合和稳定,从而抑制网格蛋白介导的胞吞途径[63,65,66]( 图 1) 。再者,在烟草原生质体中,斑鸠霉素能够特异地抑制网格蛋白依赖的胞吞途径[67,68]。

　　与 CME 途径的抑制剂相比,用于植物质膜微区分析的药物较为丰富,包括甲基-β-环式糊精( methyl-β-cyclodextrin,mβCD) 、固醇合成抑制剂顺-4-叔丁基苯基( -2-甲基丙基) -2,6-二甲基吗啉( fenpropimorph,Fen) 和磷脂类合成抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇 ( DL-threo-1-phenyl-2-palmitoylamino-3-morpholino-1-propanol,PPMP ) 等。

　　这些抑制剂的主要作用是破坏组成膜筏结构的各类脂质,也对膜筏区的蛋白分布产生影响。其中,Fen能够抑制细胞内麦角甾醇的生物合成,其作用位点是甾醇异构化 Δ8→Δ7,C14( 15)双键还原过程,或者是抑制鲨烯还原酶[69]。PPMP 是一种高活性的糖脂合成酶抑制剂,在一定浓度范围内能有效抑制中性鞘糖脂合成,而且对细胞的活力没有影响[70]。Li 等用Fen 和 PPMP 处理拟南芥细胞后,发现细胞质膜上GFP 标记的水通道蛋白 PIP2; 1 的荧光点聚合成更大的荧光颗粒,并且荧光信号的强度显着增加[71],暗示着 PIP2; 1 的分布与固醇密切相关,至少部分PIP2; 1 定位于富含固醇 / 鞘磷脂的区域。有研究表明,质膜微区抑制剂 mβCD 处理拟南芥根细胞会明显影响拟南芥质膜微区标记蛋白 AtFlot1 的胞吞[24]。除此之外,制霉菌素 ( Nystatin) 和非律平( Filipin) 同样也可以抑制质膜微区参与介导的胞吞途径[72,73]。

　　2. 2 拟南芥胞吞途径相关突变体和 RNA 干扰株系

　　2. 2. 1 参与网格蛋白介导的胞吞途径的突变体研究者利用遗传学手段鉴定了一系列网格蛋白相关突变体,这些突变体均表现出严重的生长发育缺陷[38,78 ~81]( 表 3) 。Kitakura 等在研究生长素转运蛋白 PINs 的胞吞途径时发现,拟南芥 chc 单突变植株和 CHC1 显性负突变植株在胞吞途径和细胞质膜蛋白的内化方面存在显着缺陷。阻断 CME 过程可以导致 PIN 蛋白的组成型胞吞途径发生缺陷,并干扰其在胚胎和根细胞的极性定位。另外,这些突变体还表现出胚胎形态异常、子叶数目异常、重力响应异常以及侧根数目减少等表型[37]。近年来,Wang 等研究发现 CLC2 和 CLC3 的突变会影响 CHC在细胞质膜上的定位,减少 PIN 的胞吞与细胞内转运,并扰乱生长素调节的胞吞途径。在 clc2-1clc3-1双突变体植株中,生长素的分布、敏感性和向基式运输,以及根的向重力性都发生了改变[78]。

　　除了网格蛋白的重链和轻链缺失突变体以外,AP2 复合体各个亚基的突变体也被广泛应用于CME 过程的研究中。Fan 等发现,当 AP2 σ 亚基突变之后,拟南芥植株表现出矮小、子叶发育异常、育性降低等表型,同时生长素转运蛋白 PIN1 的胞吞发生缺陷[38]。另外,Ron 等研究指出,在受到配体刺激时,番茄 LeEix2 的胞吞基序 YXX 与 AP2 的 μ2亚基相互作用,介导 LeEix2 通过 CME 进行胞吞[79]。与之类似的是,番茄中 Cf4 也具有 YXX 胞吞基序,通过与 AP2 的 μ2 亚基相互作用胞吞,并介导番茄叶霉菌( Cladosporium fulvum) 侵染后的抗病信号转导,而 μ2 亚基突变会抑制 Cf4 的胞吞,进而抑制抗病信号的转导[80]。

　　此外,研究者们还鉴定了多种动力蛋白相关的突变体。Collings 等鉴定了拟南芥动力蛋白 DRP1A的突变体 rsw9,该突变体由于细胞壁中纤维素减少而呈现出膨大、短小的根和下胚轴。在细胞水平上,动力蛋白 DRP1A 的缺失会导致根细胞中 FM4-64的内化减少,并对胞吞途径的抑制剂莫能菌素( monensin) 高度敏感[81]。

　　2. 2. 2 质膜微区参与介导的胞吞途径相关 RNA干扰株系

　　由于植物细胞中质膜微区参与介导的胞吞途径研究相对滞后,相关过程的突变体还未见报道,但是RNA 干扰株系的构建也为质膜微区参与介导胞吞过程的研究提供了重要证据。Li 等在研究 AtFlot1参与介导的胞吞途径时,利用 RNAi 技术沉默AtFlot1 基因的表达,结果发现在 Flot1 amiRNA 转基因植株中,FM4-64 的胞吞明显受到抑制。此外,Flot1 amiRNA 植株表现出茎尖分生组织生长受到抑制、植株矮小的表型[24]。

　　【23】

　　2. 3 用于植物胞吞途径研究中的生物化学技术

　　在植物细胞胞吞途径的研究中,研究者们通常利用生物化学技术分离和鉴定胞吞囊泡成分,主要过程是将细胞匀浆后通过密度梯度离心等方法,结合免疫印迹、双向凝胶电泳、液相色谱等技术来分析参与胞吞途径的各组分。近年来,蛋白质组学技术的快速发展为分析胞吞囊泡成分提供了巨大的便利,该技术主要基于凝胶电泳、液相色谱、质谱鉴定和生物信息学的方法,通过胶内酶解、序列分析及其数据库比对等手段对蛋白质进行高通量的鉴定[50],这些技术的发展对于鉴定细胞质膜微区上参与胞吞途径的蛋白质和相关的胞吞囊泡组分具有重大的意义。

　　密度梯度离心、薄层色谱等方法是提取和分析质膜微区以及胞吞囊泡组分中常用的技术手段。例如,2003 年 Berci 等首次以黄化的大豆子叶下胚轴和绿色的拟南芥叶片作为材料,运用薄层色谱法定性和定量分析了质膜油脂组成的差异[83],这一研究为区分细胞质膜微区提供了直接的实验证据。随后Depta 等利用蔗糖密度梯度离心提取了植物细胞中的 CCVs ( clathrin-coated vesicles)[84]。Preuss 等借助基于蔗糖密度梯度离心的细胞分馏法鉴定了小 G蛋白 RabA4b,并发现其位于一个新的内膜组分,该组分与根毛的尖端生长有关,并且被证明与分泌和胞吞途径均有联系[85]。值得一提的是,近年来研究者们将蔗糖密度梯度离心与具有特殊标记 ( 胶体金颗粒或同位素) 的免疫印迹方法相结合来研究植物细胞胞吞途径[86]。Tse 等借助上述方法对液泡分选受体 ( vacuolar sorting receptor,VSR) 进行荧光蛋白标记,随后通过对 VSR 的显微观察,该研究小组鉴定了烟草 BY-2 悬浮细胞的前液泡组分 ( pre-vacuolar compartments,PVCs)[87]。此外,该小组又利用电镜和免疫胶体金标记技术鉴定了多泡体( multivesicular bodies,MVBs) 。在胞吞途径中,MVBs 和 PVCs 作为晚期内涵体 ( late endosome) 来调节受体循环,其主要作用是将受体分选到 TGN 或质膜上[88 ~91]。

　　此外,一些非离子型表面活性剂也常用于抽提质膜微区组分。譬如,Borner 等用非离子型表面活性剂 Triton X-100 在低温下对植物细胞质膜粗提物进行抽提,获得了质膜 DRM 组分。其中 Triton X-100 在低温下能温和溶解脂质,而不会使蛋白变性,质膜中鞘磷脂微区结构受到 Triton X-100 的侵蚀出现孔洞并逐渐消融,从而可以达到分离细胞质膜DRM 组分的目的。此外,该研究小组利用了蛋白组学和液相色谱鉴定了一系列富集于 DRM 组分中的功能蛋白( 其中包括参与植物胞吞途径的AtFlot1)[24,50]。近年研究发现,质膜微区蛋白也参与动植物细胞胞吞途径,例如上述的膜筏微区标记蛋白 caveolin 和富集于膜筏微区的蛋白AtFlot1[2,24]。随着研究的深入,分离和鉴定植物质膜微区蛋白,并研究其是否参与植物胞吞途径,这方面的工作显得尤其重要。

　　2. 4 用于植物胞吞过程研究的标记及成像技术

　　植物细胞胞吞途径的研究离不开标记技术和显微观测技术的应用。随着各类标记技术和成像技术的发展,显微观察的分辨率和功能得到不断的拓展。新型标记技术和各种荧光显微镜的结合,譬如激光扫描共聚焦显微镜、转盘式共聚焦显微镜以及隐失波荧光显微镜等的使用,使样品分析从单层、静态、局部逐渐发展到立体、动态、全面的观察,极大地方便了对细胞胞吞过程的研究。

　　2. 4. 1 激光扫描共聚焦显微术

　　激光扫描共聚焦显微术 ( laser scanning confocalmicroscopy,LSCM) 与免疫荧光标记技术相结合,已经被广泛应用于胞吞过程以及膜蛋白循环的研究中[92,93],同时也应用于检测胞吞荧光标记分子,例如 FM 染料、filipin 等[94,95]。更为重要的是,激光扫描共聚焦显微术已经被用于研究融合荧光蛋白标签的胞吞标记蛋白以及细胞骨架的分布以及动力学分析,例如 Rab GTPases、SNAREs、GNOM 以及微管微丝等[96,97]。值得一提的是,Li 等利用了 LSCM 结合免疫胶体金标记的透射电镜,观察了 AtFlot1 与网格蛋白轻链 ( clathrin light chain,CLC) 的荧光共定位情况,结果表明 AtFlot1 蛋白与网格蛋白在亚细胞水平上分布相互独立[24]。

　　2. 4. 2 全内反射荧光显微术

　　可变角度全内反射荧光显微术 ( variable-angletotal internal reflection fluorescence microscopy,VA-TIRFM) 是在单分子水平上对细胞内的动态过程进行成像分析的一种重要技术。VA-TIRFM 是基于全内反射的原理,即当一束光在高折射率介质和低折射率介质之间的交界面发生全内反射时,光线会全部被反射回高折射率的介质中,而不会进入到低折射率的介质。但是由于光的波粒二相性,其中一部分能量会穿过界面进入低折射率的介质,产生隐失波并形成隐失场 ( evanescent field) 。这种隐失波只能将样品表面 100 ~ 200 nm 范围内的荧光基团激发,从而提高了空间分辨率,便于研究者对细胞质膜以及近膜区的生物学过程进行选择性观测,如胞吞胞吐、单个分子与细胞膜的结合和解离以及膜上受体的动态变化等过程[98,24]。Li 等利用融合荧光蛋白 GFP 标签的水通道蛋白 PIP2; 1 转基因株系为材料,借助 VA-TIRFM 实时动态监测并分析其在细胞质膜上的动力学特征,结果表明 PIP2; 1 分子的胞吞是由网格蛋白依赖途径和膜筏相关途径共同参与的[71]。另外,Wang 等利用 VA-TIRFM 结合单颗粒追踪分析技术,在单分子水平上对拟南芥根表皮细胞质膜上铵转运蛋白 AMT1; 3 进行了活体动态分析。研究发现,在正常以及铵缺乏的条件下,AMT1;3 在质膜上主要以三聚体的功能形式存在; 但是在高铵胁迫下,AMT1; 3 在特定的膜微区迅速聚集,随后通过内吞进入胞质降解,使质膜上具有转运活性的 AMT1; 3 蛋白减少,细胞的铵转运能力降低,减少了铵的吸收。这一研究揭示了植物细胞能够通过膜蛋白的不同聚合方式和胞吞降解,实现自我保护的机制[99]。

　　2. 4. 3 超分辨率成像技术

　　近几年出现的一些超分辨率成像技术打破了衍射分辨屏障[100],这类技术在显微镜的激发/发射通路以及计算机图像分析等方面做了改进,包括受激发射损耗 ( stimulated emission depletion,STED) 显微技术、激光活定位显微技术 ( photoactivatedlocalization microscopy,PALM) 和随机光学重构显微技术 ( stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)[101]。其中,STED 利用两束激光使荧光光点的衍射面积减小,显着地提高了空间分辨率,目前在生物样品中的分辨率已经达到了 20 nm 以内[102]。Eggeiling 等利用 STED 技术在活细胞中第一次观察到了纳米大小的脂质区 ( ~ 50 nm)[103]。

　　PALM 和 STORM 是基于单分子成像的超分辨率显微成像方法,它们的基本原理是利用光控开关探针标记样品,其荧光可以由特定波长的激发光开启或关闭。一小部分的荧光团被激活或漂白,最终通过点扩散函数 ( PSF) 与高斯函数拟合来估算分子的坐标,这个过程被重复多次直到建立一个完整的图像[104,105]。Betzig 等在 2008 年开发出了可应用于活细胞上的 PALM 成像技术,用于记录细胞黏附蛋白的动力学过程[104]。庄晓薇研究组研发并改进了STORM 技术,发展了不同颜色的变色荧光分子对,可以同时记录两种甚至多种被标记蛋白的空间相对定位,分辨率可达到 20 ~30 nm,他们利用这一技术阐明 clathrin 包被的胞吞囊泡与细胞骨架蛋白之间的精确空间位置关系[105]。

　　随着显微成像技术和标记技术的结合以及逐步完善,实时动态观察生物有机体内生物化学反应的过程将可以实现,人们将能够从细胞定位及功能、蛋白-蛋白相互作用、信号传递等多层面多角度来观察植物细胞胞吞途径的发生以及囊泡运输过程。这些技术的进步势必将极大地推动胞吞途径研究的发展。

　　3 展望

　　近年来,植物胞吞途径的研究取得了快速发展,越来越多的证据表明胞吞在植物信号转导过程中发挥着重要作用,涉及植物生长发育、环境信号应答等许多方面。在植物胞吞途径的研究方法中,除药理学分析、突变体等,各种类型的显微技术也被广泛应用于植物胞吞的研究,并取得重要进展。随着研究的深入,各种细胞器标记分子被运用于胞吞的研究中,譬如特异标记内质网、反面高尔基管网状结构、循环内涵体等内膜系统的荧光标记株系。这些新技术与研究方法将会极大地推动植物胞吞途径的研究工作。

　　现阶段的研究表明,植物细胞中可能存在多种胞吞途径。其中,CME 的研究相对比较透彻,而关于其它胞吞途径的研究尚不多见,各种影响因子( 环境因素、激素调节及其他调节因子等) 对植物胞吞途径的影响也研究较少。未来植物细胞胞吞途径的研究将会集中于以下三个方面: 第一,研究关于CME、CIE 的主要机制及其调节因子; 第二,深入分析激素、环境因素 ( 病原菌入侵、营养的利用、光和重力等) 对胞吞作用的影响; 第三,阐明在活体植物细胞中,胞吞途径的各个组分的动态变化和相互作用网络。这些科学问题的研究将会成为今后几年植物胞吞研究领域的热点。