葫芦砧木种子中带菌量与砧木苗期细菌性果斑病发生的关系

　　细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是多种瓜类作物的重要病害,病害主要侵染源为种子带菌。在中国,BFB是一种检疫性病害,其病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae ssp.citrulli,Aac),属革兰氏阴性菌。

　　Aac可在植株的叶片、茎部和果实等部位引起病害,尤其以苗期及果实期危害最严重。苗期发病可导致整株幼苗死亡,而在果实上发病则造成减产,甚至绝收。该病害在高温高湿的环境下发病十分迅速,迄今为止在世界范围内还没有完全免疫BFB的葫芦科作物品种。BFB在中国新疆、内蒙古、海南、湖北、河南等许多地区均有发生,并给瓜类生产造成极大的经济损失。

　　近几年来,随着育苗工厂集约化的迅速发展,西甜瓜嫁接苗技术已广泛运用于大型的育苗工厂中。

　　该技术在防治西甜瓜枯萎病等多种土传病害上具有很好的效果,但育苗工厂中育苗的密集性和适宜Aac存活与生长的高温高湿环境,也为细菌性果斑病在嫁接育苗过程中的存活和大规模爆发提供了有利条件。目前,对工厂化育苗中细菌性果斑病苗期的侵染途径研究较少。笔者分析了葫芦砧木种子中不同Aac带菌量与砧木苗期细菌性果斑病发生的关系,旨在明确细菌性果斑病通过种子带菌引起苗期发病的侵染途径,为嫁接苗工厂化育苗生产和有效防治细菌性果斑病提供理论依据。

　　1、材料与方法

　　1.1试验材料

　　供试砧木葫芦种子品种为京欣砧1号,由北京京研益农科技发展中心提供;燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Aac)菌株Pslb96由中国农业科学院植物保护研究所赵廷昌研究员惠赠。试验固体培养基为KBA培养基(蛋白胨20g、硫酸镁1.5g、磷酸氢二钾1.5g、甘油10g、蒸馏水1 000mL、琼脂20g、pH 7.0~7.4),液体培养基为KB(无琼脂KBA培养基)。育苗基质为有机营养土,由镇江培蕾基质科技发展公司生产。

　　1.2 Aac菌液配制参考Dutta等的方法配制Aac不同浓度菌液。将Pslb96株划线接种在KBA平板上,置于28℃培养箱内,培养2d后挑取单菌落,接种在KB培养液中,在30℃下摇培(250r/min)过夜。将菌液于6 000r/min离心5min。弃上清后,菌体用0.1×PBS缓冲液重新悬浮。用分光光度计测定菌悬液的吸光值(D600),并用PBS缓冲液将菌悬液的D600值调节至0.3(菌体浓度约为1×108cfu/mL。

　　最后用0.1 × PBS缓冲液将菌悬液的浓度分别调节至1×103、1×105、1×107cfu/mL。

　　1.3 Aac接种与病害调查参考王晓东的方法用不同浓度的菌悬液处理葫芦砧木种子。 砧木种子用5% NaClO消 毒5min,随后用无菌水中浸洗3次,并将其浸泡在各浓度Aac菌悬液中1h。以浸泡在无菌水中的种子作为对照,各处理48粒种子。最后将清洗后的种子在室温 下晾干过夜,在30℃恒温培养箱中催芽72h,将葫芦砧木种子播种在穴盘内的基质中,每穴1粒种子。将穴盘置于日温为28~32℃,夜温为20~22℃的温室中(无补光措施)进行育苗。分别在接种后4、6、8、10、12d逐株检查幼苗发病情况,统计发病率与病情指数。病害等级分级标准参考金岩的方法并略加修改,即按照病斑面积占总子叶面积百分比进行分级:0级,不发病;1、2、3、4、5级,病斑面积分别为<5%、5% ~20%、20% ~40%、41%~60%、>60%。各处理重复3次。

　　1.4 Aac侵染观察与病菌分离用浓度为1×107cfu/mL的Pslb96菌液浸泡葫芦砧木种子1h,并将种子播种在穴盘中,在温室播种后连续观察幼苗的发病情况和发病部位,再分别在播种4、6、8、10d后取子叶下胚轴0~3cm和3~6cm处进行Aac的分离。将幼苗的不同部位在5%的NaClO溶液中表面消毒3min,用无菌水冲洗3次后,将病组织浸入无菌水中并捣碎,静置20min使组织中病菌释放入水中。然后将组织悬液进行梯度稀释,涂布于含有氨苄青霉素(1mg/mL)和黄连素 (20mg/mL)的选择性培养基上,28℃下培养48h。统计类似Aac菌落数量。为验证分离的细菌是Aac,在平板上挑取疑似Aac单菌落5个,接种在含氨苄青霉素(1mg/mL)和黄连素(20mg/mL)的KB培养基中摇培过夜,菌液用Aac特异性引 物WFB1和WFB2进行PCR扩增以确定目标菌是否为Aac。

　　1.5 Aac在葫芦幼苗中定殖的观察。取下胚轴有明显细菌性果斑病病症的砧木幼苗,将其下胚轴发病部位剪下,并进行FAA固定,梯度乙醇脱水,石蜡渗透包埋、切片、去蜡、蕃红固绿染色、二甲苯透明、香脂封固,最后制成石蜡切片。石蜡切片的操作参考方中达的方法。制成的石蜡切片在微分干涉显微镜下进行观察,明确样品中Aac在砧木下胚轴中的定殖部位。

　　2、结果与分析

　　2.1 Aac接种量对葫芦苗期BFB发生的影响

　　试验结果表明,在相同的高温高湿育苗环境条件下,Aac菌株Pslb96不同接种量浸泡处理均可引起葫芦幼苗发生BFB,且处理间发病率及病情指数均存在显著差异。随着浸种菌体浓度的增加,在播种后不同时间观察葫芦苗期发病率和病情指数均呈上升趋势,4~8d时发病率和病情指数上升较快,8~12d时趋于缓慢 (图1)。在播种后12d,当Pslb96浸种浓度为1×103cfu/mL时,葫芦幼苗发病率达到55%,病情指数为37;当Pslb96浸种浓度为1×107cfu/mL时,葫芦幼苗发病率可达到99%,病情指数为90。

　　2.2葫芦苗期Aac的侵染过程

　　对葫芦幼苗BFB症状出现的动态观察结果表明,BFB在高温高湿的育苗环境条件下发展迅速。病害发生初期子叶有轻微水渍状病斑,随着葫芦砧木幼苗的生长,细菌性果斑病开始由发病子叶逐渐向叶基部进行扩展,并侵染幼苗下胚轴(图2)。

　　Aac病原菌分离试验结果表明,Pslb96浸种后,随着葫芦种子的萌发及幼苗的生长至4d时,子叶开始出现水渍状病斑且可在葫芦砧木幼苗子叶中分离到Aac,下胚轴健康且未分离到Aac(表1)。浸种后6d,子叶出现典型细菌性果斑病水渍状病斑,下胚轴未表现症状,但可在下胚轴距子叶0~3cm处分离到Aac;浸种后8d,除子叶外,在下胚轴距子叶0~3cm部分出现水渍状病斑并可也分离到Aac;浸种后10d,子叶、下胚轴距子叶0~3cm部分及下胚轴距子叶3~6cm部分均出现典型水渍状病症和黄褐色病斑并可分离到Aac。

　　2.3 Aac在葫芦砧木苗期下胚轴的定殖

　　发病砧木幼苗下胚轴组织横截面的石蜡切片染色观察结果表明,Aac定殖于下胚轴维管束的木质部和韧皮部中,而下胚轴薄壁组织中未观察到Aac的存在(图3)。

　　3、讨论

　　病原物能够侵入成功的影响因素之一是接种体的数量。病原物需要有一定的数量才能引起侵染和发病。本研究结果表明,砧木用葫芦幼苗期细菌性果斑病发生的严重程度与其种子含有Aac的带菌量有密切关系。在相同的育苗环境中,种子内部Aac含量越多,葫芦砧木幼苗的发病率和病情指数越高,所造成的危害越严重。而且,在较低的Aac带菌量下(103cfu/mL),12d后细菌性果斑病发病率依然可达到50%以上,病情指数达到30以上。

　　此外,随着时间的推移,砧木苗期的发病会愈发严重,甚至造成砧木的死亡。因此,对于细菌性果斑病发生严重的育苗工厂,砧木种子严格的消毒处理是非常有必要的,否则会对工厂化大规模育苗造成极大的经济损失。到目前为止,关于西瓜细菌性果斑病侵 染方面 的研究 还不够完善和深入。

　　Walcott等的研究表明西瓜细菌性果斑病可以在花期侵染花瓣而产生带菌但无病症的果实,且果实中的种子内可以检测到Aac的存在。Lessl等证明Aac在适宜的环境条件下可以迅速定殖在西瓜雌花的柱头上,并可通过输导组织侵染子房。

　　Dutta等曾解剖被Aac感染的西瓜病果中的种子,发现Aac在种子的种皮、种壳和胚中均可定殖。但是,关于西瓜细菌性果斑病菌在葫芦科作物苗期的侵染,特别是关于工厂化育苗中细菌性果斑病对砧木的侵染还鲜有报道。本试验通过对Aac在病组织内定殖位点的观察及对砧木幼苗不同部位Aac病原菌进行分离,发现Aac以种传途径作为初侵染来源时,病菌可随着砧木苗期的发育进行侵染。研究结果表明,Aac侵染后首先在幼苗子叶表现症状,环境条件适宜时发病迅速,随着幼苗的生长,病菌可沿子叶向下胚轴侵染,并使下胚轴发病。通过对下胚轴发病组织的切片观察表明,Aac定殖于葫芦砧木幼苗下胚轴维管束组织的木质部和韧皮部中造成系统性侵染。在育苗工厂高温高湿的环境中,葫芦作为嫁接砧木,如果忽视子叶上轻微的病斑,病害很容易扩展至下胚轴造成整株死亡,对育苗工厂造成极大的经济损失。但是,砧木嫁接后是否能将病菌传染给西瓜接穗,尚需进一步研究。