淡紫拟青霉菌株防治灯盏花根结线虫病的效果

　　根结线虫是一类危害大、分布广且难以防治的重要病原线虫，生产上防治该病害主要以化学杀线虫剂为主，由于化学杀线虫剂对环境污染严重，使用过程中对人、畜也不安全，因此许多化学杀线虫剂已被禁用。淡紫拟青霉 [Paecilomyces lilacinus（Thom.）Samson]是土壤及多种植物根系的习居菌，Samson1974年在秘鲁首先从根结线虫卵囊上分离到该菌，Jatala博士1979年首次发现该菌对南方根结线虫卵寄生率高达60%-70%.

　　Cayrol等1989年报道了淡紫拟青霉的培养滤液含有杀线虫物质,被各国学者广泛应用于根结线虫生防并成为商品。近年来，国内研究者也对该菌作了大量的生防研究,亦证实该菌对根结线虫有较高的寄生率，能有效控制土壤中根结线虫的数量，明显减少危害，其代谢产物对多种作物具有生理活性。为了开发利用生防菌物资源，作者近年来筛选出寄生根结线虫的淡紫拟青霉高效菌株YC0447菌株，通过室内测定及盆栽试验对淡紫拟青霉YC0447菌株防治灯盏花根结线虫病的效果进行了初步研究，为进一步田间试验提供依据。

　　1、材料与方法

　　1.1淡紫拟青霉对灯盏花根结线虫卵的寄生率测定

　　淡紫拟青霉YC0447菌株从烟草爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）卵中分离得到。

　　将生长10d的PDA平板上的淡紫拟青霉YC0447菌株孢子用灭菌水洗下，配成2.5×106个/mL孢子悬浮液。根结线虫采自云南个旧灯盏花植株。将根结线虫在番茄上繁殖，待其产卵后，随机取嫩根上早期发育的卵囊，用1%次氯酸钠表面消毒后，用灭菌水洗3次，备用。参照Nitao等的方法将根结线虫卵配制成密度为2500个/mL的卵悬浮液，吸取100μL根结线虫卵悬浮液和10μL孢子悬浮液，于2%水琼脂平板上混匀，而后轻轻涂布，以灭菌水为对照，重复3次，置于25℃下培养12d,每天镜检寄生率情况。

　　1.2淡紫拟青霉发酵液对灯盏花根结线虫2龄幼虫的致死作用

　　（1）发酵液的制备将50mL微量培养基+1%鸡蛋黄的液体培养基装入500mL三角瓶中，灭菌、冷却后，接种4块3mm×3mm的淡紫拟青霉菌块，在28 ℃黑暗条件下180r/min振荡培养5d.用无菌滤纸过滤，滤液经4 000r/min离心，除去菌丝，取上清液即为发酵粗提液用于活性测定。

　　（2）杀线虫活性测定在装有1.5mL发酵粗提液的小凹玻皿中，加入备好的灯盏花根结线虫2龄幼虫50~70条，将小凹玻皿放入大培养皿中保湿，置于25 ℃恒温箱中，分别于12h,24h,36h,48h后检测线虫的死亡率。

　　设无菌的空白培养基和无菌水作对照，重复3次，计算各处理的死线虫数和统计校正死亡率。死亡率统计方法参考盖钧镒等的方法.-:校正死亡率10%以下；+:校正死亡率11%~30%;++:校正死亡率31%~50%;+++:校正死亡率51%~80%;++++:校正死亡率大于80%线虫死活的鉴别采用NaCI检测法,用细挑针挑取僵直的线虫，置于2%NaCI中5min后，假死线虫僵直的虫体弯曲并开始运动，死亡的线虫虫体仍保持僵直不动。杀线虫活性强弱的分级按Chan-dravadana等的方法。

　　1.3淡紫拟青霉对灯盏花根结线虫的盆栽防治效果试验

　　在温室大棚内进行，供试菌孢子含量为1.47×1011个/g的淡紫拟青霉YC0447菌株麦粒菌剂，灯盏花根结线虫为南方根结线虫（M.incognita）。栽培基质为腐质土、无病土、烟草漂浮育苗专用肥按25:50:1比例混合配成，每盆1株。从感染灯盏花根结线虫的番茄病根上剪取新鲜根结，移栽时将40g病土+30个新鲜根结+20g1施于每株灯盏花根部。对照为40g病土+30个新鲜根结+20g麦粒。每一处理设20盆。接菌后按常规管理，于接种后60d将全部处理植株扣盆倒出，统计株高和地上部鲜重、根鲜重，并进行根结严重度分级,计算病情指数和防治效果。

　　2、结果与分析

　　2.1淡紫拟青霉对灯盏花根结线虫卵的寄生效果

　　在水琼脂平板上混合接种淡紫拟青霉YC0447菌株孢子和线虫卵，8 d后观察有44.62%的卵被寄生，随着时间的延长，卵的寄生率不断加快，12d后观察有83.50%的卵被寄生，对照中的卵和处理中未被寄生的卵发育和孵化也相应加快。光学显微镜观察发现接种淡紫拟青霉3d后菌丝侵入卵中，5~6d后卵壳表面布满菌丝，表面粗糙，8d后卵粒变形变软，卵完全被淡紫拟青霉菌丝所包裹。

　　2.2淡紫拟青霉发酵液的杀线虫活性

　　不同浓度淡紫拟青霉发酵液对灯盏花根结线虫2龄幼虫致死活性测定结果见表1.从表1中可以看出，淡紫拟青霉发酵液对灯盏花根结线虫致死效果较好。当发酵液浓度稀释到40%时，48h后的校正死亡率达80%以上（++++）；在浓度为60%时，校正死亡率与浓度为80%时差别不大。说明发酵液稀释到60%时的杀线虫效果最佳。

　　2.3淡紫拟青霉发酵液致死的根结线虫2龄幼虫死亡状态观察

　　经淡紫拟青霉发酵液处理12h,24h,36h,48h的根结线虫2龄幼虫用2%NaC1检测其死亡情况，并观察虫体结构的变化。用发酵液处理1h后，线虫的活动变得迟钝，僵直假死的根结线虫经2%NaC1处理5min后虫体恢复弯曲并开始运动。

　　12h后的线虫僵直并死亡，能看出其内部结构发生微小的变化，线虫的体腔内部结构部分消解，同时产生液泡。24h后可以清楚地观察到死亡的线虫的体腔内部结构产生大量消解，体壁与肠分离。48h后从口腔开始变得模糊，有的看不清口针，食道模糊，尾部的内部结构与体壁分离，体腔内部结构几乎完全消解。

　　2.4淡紫拟青霉对灯盏花根结线虫病的防治效果

　　盆栽试验结果（表2）表明，防治的平均株高比对照高9cm,地上、地下部鲜重显着高于对照，100g土中幼虫数量明显减少，病情指数降低，花数增加，防治效果为64.7%.经防治的灯盏花根系发达、健壮,而未防治的灯盏花根系较稀疏，嫩根上1.防治的灯盏花根系只有少量根结出现于老根和上部根上，其病情指数明显低于对照。由此推测，淡紫拟青霉菌剂对根有一定的保护作用，在控制根结线虫再侵染过程中发挥了重要作用。

　　3、讨论

　　本研究表明，淡紫拟青霉YC0447菌株对灯盏花根结线虫分散卵的寄生率为83.50%,对卵囊的寄生率未做测定。陈淑鸿等采用双温测定法，测得淡紫拟青霉对爪哇根结线虫卵囊和分散卵粒的相对孵化率分别为57.4%和23.75%.汪来发等认为这可能与菌丝寄生卵的机制有关，在寄生过程中孢子要先附着在卵表面萌发，继而菌丝发育而缠绕整个卵，而卵囊中的粘性基质更有利于孢子的附着萌发和菌丝发育，分散卵由于受表面消毒的影响，没有了粘性基质且部分卵始终不能孵化.盆栽试验以新鲜根结、病土和淡紫拟青霉混合接种，比较符合田间实际，未设计不同剂量处理，需进一步探讨多个剂量处理试验，为田间试验施用剂量提供依据。

　　淡紫拟青霉自然寄生率低，为了开发生防菌物资源，研究者们对该菌作了大量的生防研究，目前已广泛应用于防治根结线虫、孢囊线虫等有害植物线虫的防治实践中。但由于土壤存在不同程度的抑菌现象及菌株本身与植物根部亲和力的影响，这是应用生防菌防治植物寄生线虫不稳定的重要原因.

　　因此有必要从生防菌次生代谢物中寻找具有活性的物质。

　　Park等在淡紫拟青霉发酵液中检测到灰白制菌素 （Leucinostatin）的产生，且具有杀线虫活性.淡紫拟青霉发酵液中检测到6种具有内切活性的几丁质酶，灰白制菌素同几丁质酶相结合，可作为筛选高效淡紫拟青霉生产菌株的指标.此外淡紫拟青霉发酵液还具有类似生长素和细胞分裂素的作用，可能含有此类物质.

　　淡紫拟青霉YC0447菌株在寄生分散卵、发酵液杀线虫活性和盆栽试验中取得了较好的效果，因而有一定的开发应用前景。但由于诸多生态因素的影响，准确掌握根结线虫产卵囊时期，在产卵囊前施用菌剂。研发YC0447菌株剂型、施用方法、与次生代谢产物混用方法及用药量等是该生防菌必须进一步解决的重要问题。