植物内生菌防治植物寄生线虫的相关问题及发展趋势

　　植物寄生线虫是重要的植物病原物之一，分布广，种类多，主要包括根结线虫、松材线虫、大豆孢囊线虫、茎线虫及香蕉穿孔线虫等，据不完全统计，全世界每年因寄生线虫造成的农作物经济损失约在 1 000 亿美元以上。长期以来，广泛使用化学药剂对线虫病害进行防治虽取得较好的效果，但存在高毒、高残留的弊端。近年来，随着人们环保意识的增强和高毒、高残留农药的禁用，生物防治日益受到重视，并且被认为是最具发展前景的防治手段。为此，国内外学者开展了大量的研究工作，对植物寄生线虫有生防潜力的微生物已成为研究的热点。目前从土壤微生物中分离出的被应用到生产实践中的生防菌有阿维链霉菌、芽孢杆菌、淡紫拟青霉等，且由阿维链霉菌开发的高效、低毒、广谱的阿维菌素已进行商业化生产，被广泛应用，发展前景广阔。但近年来从土壤微生物中获得对植物寄生线虫有生防作用菌株的比例逐年下降，而从另一类较新的微生物类群——植物内生菌中分离出对植物寄生线虫有生防作用菌株的研究受到人们的重视，成为分离获得植物寄生线虫生防菌的重要来源。因此，本研究是从植物内生菌的分布和种类、分离培养、活性筛选、活性物质成分以及防治植物寄生线虫的作用机理几方面进行综述，并对植物内生菌防治植物寄生线虫的相关问题及发展趋势进行了探讨，以期为深入开展相关研究提供参考。

　　1、分布和种类

　　植物内生菌（Endophyte）指那些在生活史的某一阶段或者全部阶段生活在健康植物组织或器官内的真菌、细菌或放线菌，被感染的宿主植物不表现外在症状。在目前研究过的所有植物中均发现内生菌，它们存在于植物的根、茎、叶、花、果实等各个部位。目前已报道的内生细菌超过 129种（隶属于 54 个属），内生真菌达到 171 个属，内生放线菌主要为链霉菌（Streptomyces）、链轮丝菌（Streptoverticillum）、游动放线菌（Antinoplanes）、诺卡氏菌（Nocardia）、小单胞菌（Micromonospora）。

　　可见，植物内生菌在植物体内的分布具有普遍性和多样性的特点，这为开展植物内生菌防治植物寄生线虫的研究提供了有利资源。目前已发现的具有防治植物寄生线虫作用的内生真菌有尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、菜豆拟茎点霉（Phomopsisphaseoli）、Melanconium betulinum、Geotrichumsp.AL4、球毛壳菌（Chaetomium globosum）等；内生细菌有假单胞菌属（Pseudomonassp.）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等 ；内生放线菌如I07A-01824等。

　　2、分离培养方法

　　植物内生菌的分离方法主要有两大类 ：一类为传统的分离培养方法 ；另一类为新近发展起来的非培养方法。传统的培养法分离植物内生菌有很大的局限性，主要归因于人们对植物内生菌的认识还不够全面客观，许多内生菌的生长条件还未确定 ；其次，在筛选过程中，受培养基选择性的限制，很多寄生程度高、与寄主植物密切相关的固有菌会被漏掉。因此，约有 90%-99% 的环境微生物用传统的培养法无法进行分离。但因为传统的培养法能够得到菌株实体，所以在新物种资源的发掘等方面有着不可替代的作用，仍是微生物资源开发利用的主要方法。研究植物内生菌次生代谢产物及其生物活性，多采用传统的分离培养法。由于分离培养法具有局限性，为了获得尽可能多的内生菌，一般采用多种分离培养基对内生菌进行分离。目前，国内学者在分离内生真菌中常用 PDA 培养基、察氏培养基等，为了抑制细菌和其他杂菌的生长，通常还将选择性生长抑制剂加入到分离培养基中；分离内生细菌常用牛肉膏蛋白胨（NA）、Luria-Bertani培养基（LB）等 ；分离放线菌常用高氏一号培养基、黄豆粉琼脂培养基等，为防止生长快的菌种阻止或掩盖生长缓慢菌种，营养贫乏的培养基也常用于分离内生菌。在进行植物内生菌群落结构多样性研究及种属鉴定时常用非培养法。

　　3、活性筛选方法

　　在植物内生菌杀线虫活性筛选时，一般采用室内离体试验和盆栽测效试验相结合的方法进行。杀线虫毒力测定和孵化抑制活性测定主要是触杀法（浸渍法），即将供试线虫或卵囊放入已配好的内生菌发酵提取物的药液中，经一定时间处理后，在解剖镜下检查线虫死活和被击倒的情况或孵化率和线虫卵的发育进度。繁殖抑制测定一般采用药剂培养基法、棉球法和培养基喷雾法，这 3 种方法的不同之处在于药剂培养基法是将药剂与培养基混合制成药剂培养基，然后再往培养基上接种供试线虫；棉球法是将药剂和供试线虫注入培养基的棉球上；而培养基喷雾法是将药液直接喷雾在接种供试线虫的培养基上。忌避活性测定一般采用药剂培养基法和棉球法，这里的药剂培养基法是将培养基配成一定浓度的药剂培养基，待培养基完全凝固后，将药剂培养基和对照培养基分别从各自中间分开，然后对半互换，在培养基上接种菌株，待菌长满平板后在分界线的中央放入脱脂棉球，接种供试线虫，一定时间后分别取药剂培养基和对照培养基分离并计线虫数；而棉球法是在培养皿的中间和边缘分别放置脱脂棉球，中间棉球接种线虫，一边棉球加药液，一边棉球加溶剂做对照，一定时间后分别检查两边棉球上线虫数。虽然繁殖抑制测定和忌避活性测定都用到了药剂培养基法和棉球法，但在操作上还是有区别的。利用药剂培养基法进行繁殖抑制测定时，培养皿里的药剂培养基和对照培养基各自是完整的 ；在进行忌避活性测定时，培养皿里的药剂培养基和对照培养基分别从各自中间分开，然后对半互换。利用棉球法进行繁殖抑制测定时，是将药剂和供试线虫注入培养基的同一个棉球上 ；在进行忌避活性测定时，是将药剂和供试线虫注入培养基的不同棉球上。盆栽试验一般采用灌根法或浸根法进行研究。灌根法是将一定浓度的内生菌发酵液或菌液灌入植株根区的一种施药方法 ；浸根法是将植物根系在一定浓度的内生菌发酵液或菌液中浸泡一定时间后再移栽的一种施药方法。

　　4、活性物质成分

　　对植物内生菌的研究尽管起步较晚，但发展很快。植物内生菌代谢产物繁多，目前已发现的主要生物活性物质有萜类、生物碱、皂苷类、芳香类、苯丙烷类、有机酸类、多肽类等化合物。关于植物内生菌杀线虫及其活性物质的研究虽然也取得了一定进展，但还处于起步阶段。一方面，仅有少数分离自植物内生菌的杀线虫化合物被报道，如乙酸，Pregaliellalactone，3-hydroxypropionicacid，l-（2，4-dihydroxyphenyl）-ethanone、1-［（2R*，4S*，5S*）-2-chloro-4-methyl-l，3-oxazinan-5-y1］ethanone 和 1-［（2R*，4S*，5R*）-2- chloro-4- methyl-1，3-oxazinan-5-y1］ethanone，Chaetoglobosin A，（R）-（-）-2-ethylhexan-1-ol和不饱和脂肪酸 5，8-二烯十四酸等。另一方面，从桂皮、香蕉、衣索比亚咖啡、黑胡椒、野生大豆等植物中分离出对植物寄生线虫或卵有毒杀或抑制作用的内生菌，但这些内生菌杀线虫活性的有效成分尚不清楚，有待进一步研究。

　　5、防治植物寄生线虫的作用机理

　　植物内生菌防治植物寄生线虫的机理研究目前还不多，因此，对其作用机理还不太清楚，研究者普遍认为主要表现在通过产生杀线虫活性代谢物质影响植物寄生线虫体内各种酶和代谢反应，改变根系分泌物影响植物寄生线虫的卵孵化以及线虫的寄生，与植物寄生线虫竞争营养物质和空间位点影响线虫的侵染，增强宿主植物的抵抗力、诱导植物产生系统抗性等几个方面。

　　5.1 产生杀线虫活性代谢化合物

　　线虫体内存在有各种水解酶类、氧化还原酶和转移酶类等，这些酶对线虫的生存为害有着重要的作用。多数内生菌对植物寄生线虫的影响是通过产生次生代谢产物对线虫体内不同酶系和代谢反应的作用而致使线虫活性下降甚至死亡。李洪涛等初步确定了 S506 对线虫的杀伤作用主要是胞外代谢产物。罗红丽等通过研究链霉菌和诺卡氏菌菌株对根结线虫卵的寄生率和幼虫死亡率情况，推测菌株对根结线虫的拮抗机制可能与菌株的代谢活性产物有关。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）能产生胞外蛋白酶，水解包括线虫角质层和胶原等，造成线虫内溶物的泄漏，最终杀死线虫。有些细菌产生杀线虫毒素，如苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）在代谢过程中产生晶体蛋白毒素，引起线虫肠内膜渗透性增大，从而破坏线虫肠道组织，致使线虫死亡。有些植物内生细菌如荧光假单胞菌 89B-61（Pseudomonas fluorescens89B-61）、泡囊假单胞菌IN884（Brevundimonas vesicularisIN884）以及枯草芽孢杆菌的代谢物也能够防治南方根结线虫。

　　5.2 改变寄主根系分泌物

　　根系分泌物能影响线虫卵孵化、线虫趋向于根的运动、线虫与寄主的识别及在根上的寄生与分布。王雪等研究发现感病大豆品种根系分泌物能刺激胞囊线虫的孵化，而抗病品种根系分泌物对胞囊线虫的孵化未表现明显刺激作用。同时，在研究不同抗性品种根系分泌物对大豆胞囊线虫二龄幼虫趋化性的影响时还发现，感病品种根系分泌物对大豆胞囊线虫二龄幼虫表现了明显的吸引性。通常一些植物寄生线虫需要寄主植物产生的某种促进卵孵化的因子，而特定根围的微生物可消耗根系分泌物或改变分泌形式，从而影响这类线虫的发育。

　　如 Westcot III 等认为，施入铜绿假单胞菌（Pse-udomonas aeruginosa）后，小环线虫的卵很快会停止发育，这可能与细菌影响植物根系的分泌物有关。

　　5.3 竞争营养和空间位点

　　具有生防作用的植物内生菌施入土壤后，对植物寄生线虫的作用机制可能与线虫竞争营养和空间位点有关。有研究者发现，线虫与根的相互识别是根表面的外源凝聚素与线虫体表糖类之间的相互识别。也有研究发现对线虫有作用的革兰氏阴性细菌的细胞壁双层脂膜上具有结合植物外源凝聚素的结构。从以上两个发现可以推断某些革兰氏阴性菌可能与线虫的生态位部分重叠而发生两者之间的竞争排斥，竞争的结果是革兰氏阴性菌凭借数量众多的优势优先占据线虫的侵染位点，并在根部定殖，消耗根围营养，最终占据空间位点，间接地减少了线虫侵染率。如 Hallmann 等研究发现棉花内生细菌与线虫相互作用过程中，有的内生细菌在线虫侵染部位的种群数量明显增加，线虫的侵入可能增加了内生细菌的进入位点。

　　5.4 诱导植物系统抗性

　　植物根际促生菌（PGPR）主要通过诱导植物的系统抗性来防治植物病虫害，而荧光假单胞菌是一类能够引起植物系统抗性的主要类群。用荧光假单胞菌 P29、P80 菌株和芽孢杆菌 Bl 菌株诱导白三叶草产生对胞囊线虫（Heterodera trifolii）的系统抗性，能降低雌虫产卵率或增加雌虫畸形率。铜绿假单胞菌 IE-6S+ 和 CHAO 两菌株能诱导番茄产生高于对照 42％和 29％的系统抗性。此外，内生真菌尖孢镰刀菌菌株 162 也能够诱导番茄产生抗性，显著降低南方根结线虫的感染率。

　　6、问题与展望

　　植物内生菌在农业生产中表现出促生、抗病虫、增强宿主抗性的作用，随着我国对生态环境的日益重视，对植物内生菌的开发和广泛应用一定会很快到来。目前，虽然在防治植物寄生线虫方面取得了一定成效，但在生产实践中还存在一些问题，主要包括两个方面 ：一是具有线虫生防能力的植物内生菌仍然有许多未知的种类需要挖掘，已知的具有生防潜力的内生菌在田间自然条件下定殖能力差。很多植物内生菌的生存和培养条件还不清楚，致使大量的内生菌无法在实验室条件下分离培养。大多数生防菌是在试验条件下筛选鉴定的，与田间自然条件有很大区别，这些生防菌在田间施用后往往因定殖能力弱而降低生防效果 ；另一个是缺乏高效稳定的生防菌株。在试验条件下，有的生防菌的防效不错，但在田间施用后，由于田间施用、残留的农药，种群数量迅速下降而使防效降低 ；且目前生防菌制剂多为活菌制剂，田间应用时常受到温度、湿度、土壤 pH 值等外界因素的影响而使防效不稳定。

　　因此，植物内生菌防治植物寄生线虫的研究应从以下几个方面努力 ：第一，扩大对杀线内生菌资源种类调查和挖掘，尤其是加强对具有杀线虫作用新的植物内生菌种类的认识，将更多的内生菌资源有效地应用于线虫防治，进一步开拓我国线虫防治的新领域 ；第二，加强对植物内生菌杀线虫活性成分的研究与应用。目前从杀线内生菌中分离、提纯、鉴定杀线虫活性化合物及应用的研究还处于初步探讨阶段，今后加强这方面的研究，为新型、高效微生物源杀线剂的研制和合理应用提供科学的理论依据 ；第三，加强对生防内生菌施入土壤后的定殖、消长规律等生态问题的研究和认识，为发挥内生菌在植物寄生线虫综合治理中的重要作用奠定基础。

　　参考文献：
　　［1］路雪君 , 廖晓兰 , 成飞雪 , 等 . 根结线虫的生物防治研究进展［J］. 中国农业科技导报 , 2010, 12（4）：44-48.