新型苏云金芽胞杆菌基因的分离、筛选及其杀虫特性研究

　　几十年以前人们已经开始利用微生物来控制害虫。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称 Bt）是一种独特的细菌，它与许多化合物一起用于防治害虫，并且已经商业化，对农业和环境有重要贡献。尽管其它细菌，包括乳状芽胞杆菌（Bacilluspopilliae）和球形芽胞杆菌（Bacillus sphaericus），也用作微生物杀虫剂，但是它们的杀虫活性谱与 Bt 相比十分有限。重要的是，Bt 对人类是安全的，也是世界上应用最广泛的环境友好型生物杀虫剂。Bt 杀虫基因已经转化到几种主要的作物中，获得了抗虫的转基因植物，进而提供了农业遗传工程模型。

　　第 9 版的《伯杰氏细菌鉴定手册》将其归属于第二类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种。

　　Cry1 类杀虫晶体蛋白对多种鳞翅目害虫具有高效的杀虫活性，是 Bt 杀虫晶体蛋白中研究最为深入的一类，目前杀虫晶体蛋白的作用方式主要是通过 Cry1类蛋白进行研究的。随着cry1类基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物中的广泛应用，抗 Bt 毒素的昆虫已经出现，由于这一威胁，人们希望得到能同时作用在同一害虫上的不同种类的 Bt 蛋白。由于 Cry2Aa蛋白对鳞翅目和双翅目都有活性，所以对 Cry1 类蛋白产生抗性的昆虫，Cry2Aa 蛋白对其也有活性。

　　Cry2Aa 与 Cry1Aa 的氨基酸序列同源性只有 20%。

　　然而这两种蛋白的三维空间结构非常相似。这说明 Cry2Aa 蛋白的杀虫机制和许多其它 Cry 蛋白的杀虫机制相似。所以应用 Cry2Aa 来减缓抗性昆虫的出现是有价值的。人们已经提出交替使用 Cry1A 类和 Cry2A 类蛋白来解决抗性问题。长期以来，新型 Bt 基因的分离、筛选以及培育转 Bt 杀虫基因植物，一直是世界上众多国家研究的热点。因此充分发掘我国 Bt 杀虫基因资源已经成为一项极有价值的工作。为此，本研究从土壤中分离 Bt 菌株并筛选和克隆杀虫基因，以期获得具有较高杀虫活性的新型cry1类和cry2类基因。

　　1、材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株与质粒 本研究涉及的菌株和质粒见表1。

　　1.1.2 培养基 液体 LB 培养基 ：1.0% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1.0% 氯化钠，pH7.0。固体 LB培养基：在液体 LB 培养基中加1.3%琼脂。固体1/2LB培养基 ：1.0% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1.0%氯化钠、1.3% 琼脂，pH7.0。

　　1.1.3 试剂 限制性内切酶及连接酶、Pfu购自GiBcol、TaKaRa 公司。dNTP、Taq酶等购自上海生工生物工程公司。分析纯化学试剂均为市售。

　　1.1.4 试虫 小菜蛾（Plutella xylostella）、棉铃虫（Helicoverpaarmigera）和亚洲玉米螟（Ostriniafurna-calis）来自中国农科院植物保护研究所提供的标准化试虫。

　　1.1.5 PCR 扩增引物 鉴定引物与全长引物均由上海生工合成。引物序列见表 2。

　　1.2 方法

　　1.2.1 晶体形态观察 将 Bt 菌株 V4 在 1/2LB 培养基上培养 48 h 后，将胞晶混合液滴于载玻片上，涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色 3 min，清水冲洗，100× 油镜进行镜检，石炭酸复红染液配制方法参见文献［11］。显微镜下观察晶体释放后，刮取培养物 100 mg 用灭菌蒸馏水洗 3-4 遍，悬浮于1 mL 无菌水中，将芽胞和晶体混合液滴于玻璃片上，待其干燥，经锇酸固定后酒精梯度脱水，临界点干燥，离子溅射喷金（2 nm），HITACHI S -3400N 扫描电镜观察拍照。

　　1.2.2cry1Ea基因和cry2Aa基因的鉴定及测序 参照宋福平等方法，通过cry1类全长通用引物L5un3/L3un3、cry2类半长通用引物 S5un2/S3un2，以 Bt 菌株 V4 基因组为模板，利用Taq聚合酶进行PCR 扩增，PCR 反应体系为模板 1 μL，引物对各 1μL，2× Taqmix 10 μL，ddH2O 补至 20 μL。PCR 反应 程 序 ：94℃ 8 min ；94℃ 1 min 53℃ 1 min，72℃4 min，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。获得的cry1类 PCR 产物进行 PCR-RFLP 酶切分析，随后将PCR 产物回收与 pMD19-T 载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌 JM109，筛选出阳性转化子，送于上海生工测序。按照已经发表的cry2Aa基因序列，参照文献设计了扩增全长cry2Aa开放阅读框的引物Q2AaF/Q2AaR，并进行cry2Aa全长基因的扩增，引物序列见表 2。

　　1.2.3cry1Ea和cry2Aa基因序列测定、诱导表达及SDS-PAGE 分析 以 BtV4 菌株的基因组为模板，利用 KOD 高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为 ：模板 1 μL，引物对各 1 μL，MgSO43 μL，dNTPs 5 μL，10×Buffer 5 μL，KOD 酶 1 μL，ddH2O补 至 50 μL。PCR 反应程序 ：94℃ 2 min ；98℃ 10s，51℃（cry1Ea）/54℃（cry2Aa）30 s，68℃ 4 min（cry1Ea）/2 min（cry2Aa），30 个循环 ；最后 68℃延伸 10 min。之后参考文献［14］。

　　1.2.4 Cry1Ea 蛋白纯化和 Western blot 印迹 Cry1Ea蛋白纯化用康为世纪的 Ni-Agarose His 标签包涵体蛋白纯化试剂盒进行纯化。用 Bio-Rad Mini Trans-BlotElectrophoretic Transfer Cell 装置进行 Western blot，封闭液为 5% 脱脂牛奶，一抗为 Mouse Anti-His TagMonoclonal Antibody， 二 抗 为 Peroxidase-ConjugatedAffiniPure Goat Anti-Mouse lgG（H+L）。利用 AEC 酶底物试剂盒进行显色反应。

　　1.2.5 生物活性测定 采用饲料混合法进行杀虫生物活性测定。将 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）溶解的粗提蛋白制备成蛋白样品溶液，将粗提蛋白溶液与饲料搅拌混匀，分装于经过消毒的培养皿中，挑选活跃的初孵幼虫接于饲料上，进行生物活性测定，每个处理重复 3 次，小菜蛾和玉米螟每个重复为 30 头试虫，棉铃虫每个重复为 24 头试虫。将 10 mmol/LTris-Cl（pH8.0）溶液作为阴性对照，利用同样的方法处理 Cry1Ac 蛋白作为阳性对照。试虫的饲养条件为 28℃、相对湿度为 70%-80% 的光照培养箱中培养，小菜蛾初孵幼虫饲育 48 h、棉铃虫和玉米螟初孵幼虫饲育 168 h 后调查死、活虫数量。

　　2、结果

　　2.1 晶体形态观察

　　Bt 菌株 V4 产生的晶体形态，如图 1 中光学显微镜下箭头所示，从左到右依次为双锥形晶体和立方形晶体 ；电镜图片中箭头所指，从左到右依次为立方形晶体和双锥形晶体。

　　2.2cry1Ea基因和cry2Aa基因的鉴定

　　PCR 鉴定发现 Bt V 菌株中含有cry1类cry2类基因，应用引物 L5un3/L3un3 和 S5un2/S3un2 对 BtV4 菌株的基因组进行 PCR 扩增结果，见图 2 和图 3。对cry1类全长基因进行 RFLP 酶切分析，确定该基因为cry1Ea基因（图 4）。参考测序结果，登录 NCBI 进行序列比对，发现该菌株含有cry2Aa基因。利用全长引物 Q2AaF/Q2AaR 扩增 V4 菌株中的cry2Aa基因，PCR 扩增结果见图 5。

　　2.3cry1Ea和cry2Aa全长基因的克隆和表达

　　利用全长引物 L5un3/L3un3 和 Q2AaF/Q2AaR扩增 BtV4 菌株中的cry1Ea和cry2Aa基因，将扩增产物分别克隆到 pEB 载体并筛选平末端连接正确的重组质粒 pEB1Ea12 和 pEB2Aa16。对重组质粒pEB1Ea 和 pEB2Aa 基因的测序结果显示，BtV4 菌株中的cry1Ea全长基因大小为 3 507 bp，编码 1 169个氨基酸残基，分子量为 130 kD，并在国际基因库GenBank 中登记，其登录号为 KF601559，由 Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ea12。该菌株中的cry2Aa全长基因大小为 1 917 bp，编码639 个氨基酸残基，分子量为 60 kD，并在国际基因库 GenBank 中登记，其登录号为 KF667522，由 Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry2Aa16。

　　其中，cry1Ea12与cry1Ea11相似性最高，相似度为98.12%，有 65 个碱基差异 ；cry2Aa16与cry2Aa15相似性最高，相似度为 99.47%，有 7 个碱基差异。

　　对cry1Ea和cry2Aa基因进行诱导表达，对表达产物进行的 SDS-PAGE 电泳分析结果（图 6）显示，两种表达蛋白被检测均在沉淀组分中，转入重组质粒 pEB1Ea12 的 Rosetta（DE3）菌株中检测到130 kD 的目的蛋白，在转入重组质粒 pEB2Aa16 的Rosetta（DE3）菌株中检测到 60 kD 的目的蛋白，与Bt 菌株 V4 产生的蛋白大小一致。以空质粒 pEB 转入 Rosetta（DE3）菌株作为阴性对照，未发现表达的 130 kD 或 60 kD 的蛋白，以上结果说明在大肠杆菌中成功的表达了上述蛋白。

　　2.4 Cry1Ea蛋白的纯化和Western blot印迹

　　为了进一步验证cry1Ea基因表达是否正确以及蛋白纯度，对 Cry1Ea 蛋白进行纯化，并进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，结果见图 7。Western blot 印迹结果，见图 8。

　　2.5 Cry1Ea和Cry2Aa及BtV4蛋白杀虫活性的测定

　　提取 Cry1Ea 和 Cry2Aa 表达产物的沉淀组分以及 Bt 菌株 V4 蛋白进行杀虫活性测定，本试验进行了初筛杀虫活性测定。将 3 种蛋白分别设定一个浓度处理，对小菜蛾和棉铃虫为 20 μg/g，对亚洲玉米螟为 50 μg/g，每个处理重复 3 次，并用 10 mmol/LTris-Cl 溶液作为阴性对照。初筛结果（表 3）表明，Cry1Ea 和 Cry2Aa 蛋白对 3 种害虫的杀虫活性很低，但表现出明显的体重抑制，而同时含有该两种蛋白的 Bt 菌株 V4 蛋白的杀虫活性很高。由于供试昆虫数量不足，没有对 Cry1Ea 纯化蛋白进行生物活性测定，也没有做 Cry1Ea 和 Cry2Aa 两种蛋白的混合增效试验，有必要后续继续进行这两个试验。

　　

　　3、讨论

　　本研究通过 PCR 扩增反应以及 PCR-RFLP 酶切鉴定，首先确定 Bt 菌株 V4 含有cry1Ea基因，随后发现该菌株也含有cry2Aa基因。Bt 菌株 V4 同时含有cry1Ea和cry2Aa基因，对两种基因表达的蛋白进行杀虫活性测定，结果并不理想。有 3 种可能解释杀虫活性的测定结果 ：一是由于碱基的差异导致Cry1Ea12 和 Cry2Aa16 蛋白的空间构象发生改变，致使其杀虫活性明显降低，Cry1Ea 和 Cry2Aa 蛋白对小菜蛾活性很高并且与其它蛋白具有显著的协同增效作用，而 Cry2Aa 与 Cry1A 类蛋白作用于昆虫的受体不同，这能够解释为什么 Cry2A类蛋白能杀死对 Cry1A 类蛋白产生抗性的昆虫，所以 Cry1Ea 蛋白和 Cry2Aa 蛋白有可能具有协同增效作用，极大增加彼此的杀虫活性，但由于供试昆虫数量不足，并没有做两种蛋白的协同增效试验 ；二是有可能存在其它未知基因，表达的蛋白具有很高的杀虫活性 ；三是本试验采用包涵体蛋白进行生物活性测定，但是包涵体蛋白降解速率较快，而生物活性测定时间较长，这可能导致杀虫活性的降低。

　　此外，Cry2Aa 蛋白对双翅目也有高活性，可以对本试验的两种蛋白进行其它不同害虫的生物活性测定，因此有必要进行后续研究和重复性试验，这对于构建高效工程菌、转抗虫基因植物、解决昆虫对杀虫基因产生抗性等问题是有意义的。

　　4、结论

　　以本实验室分离得到的 300 株苏云金芽胞杆菌菌株 DNA 基因组为模板，利用cry1类全长通用引物进行 PCR-RFLP 基因鉴定，发现 Bt 菌株 V4 含有cry1Ea基因，克隆基因全长序列为 3 507 bp，编码 1 169 个氨基酸残基，分子量为 130 kD，并在国际基因库 GenBank 中登记，其登录号为 KF601559，由 Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ea12。同时发现该菌株还含有cry2Aa基因，克隆基因全长序列为 1 917 bp，编码 639 个氨基酸残基，分子量为 60 kD，并在国际基因库 GenBank 中登记，其登录号为 KF667522，由 Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry2Aa16。将两种基因在大肠杆菌 Rosetta（DE3）中表达，并表达蛋白进行杀虫活性测定，两种基因表达的蛋白杀虫活性不高，但 Bt菌株 V4 蛋白具有较高的活性。