二化螟水稻种群和茭白种群对Cry蛋白及化学药剂的敏感性差异

　　原标题:二化螟的水稻种群和茭白种群对杀虫剂和Cry蛋白的敏感性比较
　　摘要:采用微量点滴法测定了二化螟的水稻和茭白种群幼虫对杀虫剂辛硫磷、毒死蜱、氯虫苯甲酰胺、杀虫单和阿维菌素的敏感性,采用人工饲料胃毒法测定了二化螟对Cry蛋白(Cry1Ac、Cry2Aa、Cry1Ca)的敏感性,目的是为二化螟科学防治和抗性治理提供理论基础。结果表明:二化螟两寄主种群对阿维菌素和氯虫苯甲酰胺的敏感性差异显着,但对其他3种药剂及Cry蛋白的敏感性差异不显着。水稻种群和茭白种群对5种杀虫剂的敏感性由高到低均为阿维菌素>氯虫苯甲酰胺>辛硫磷>毒死蜱>杀虫单;对3种Cry蛋白的敏感性由高到低为Cry1Ca>Cry1Ac>Cry2Aa。因此,针对不同寄主田的二化螟种群应采用不同类型的药剂,尽量不使用单一药剂,可考虑采用药效最好的阿维菌素与其他几种药剂进行混配施用。
　　关键词:二化螟;寄主种群;杀虫剂;Cry蛋白;敏感性

　　二化螟(Chilosuppressalis)是一种重要的农业害虫,寄主范围广,其中包括禾本科的水稻(Oryzasativa)和茭白(Zizanialatifolia)。研究表明,来源于水稻田和茭白田的二化螟种群在生理、生态、形态及行为等方面存在差异,表现出部分生殖隔离,有学者将其分为水稻种群和茭白种群[1-4]。二化螟两种群危害水稻和茭白后,严重影响水稻和茭白的产量及质量,造成重大经济损失。因此,对二化螟进行有效的防控在农作物保护和生产活动中显得尤为重要。

　　化学防治是控制二化螟的有效措施之一。然而,长期不合理使用化学杀虫剂导致二化螟对多种药剂产生抗药性。1962年,日本学者报道了二化螟对有机磷药剂存在抗药性[5];近年来,国内外陆续报道了二化螟对有机磷类、沙蚕毒素、氨基甲酸酯类、阿维菌素等杀虫剂产生抗药性[6-7];可见,二化螟对杀虫剂产生抗药性的速度呈上升趋势。为有效地控制害虫的危害,并减缓其产生抗药性的速度,转基因技术等新型的害虫防治手段发展迅速,并逐渐应用于实际生产中害虫综合防治。

　　目前,转基因抗虫水稻已通过田间试验,国内已有转基因水稻品种获得安全认证。虽然转基因抗虫水稻在害虫治理上提供了新思路,但是与二化螟对化学药剂产生抗药性一样,二化螟对转Bt基因水稻产生抗药性的风险也受到广泛关注。研究表明,二化螟对不同的Bt杀虫蛋白(Cry蛋白)如Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Ca等的敏感性存在差异[8-9]。当田间选择压力在50%~90%时,二化螟对Cry1Ac的耐受性提高10倍需58~133代,对Cry1Ab的耐受性提高10倍需14~32代[10]。由此推测,在大面积商业化种植转Bt水稻长期后,二化螟对Bt杀虫蛋白存在产生抗药性风险的可能。

　　昆虫取食不同寄主后,其对外源有毒物质的敏感性存在差异。早期的研究发现,二化螟水稻种群对有机磷杀虫剂的敏感性显着低于二化螟茭白种群[2]。研究两寄主种群对其他化学药剂和Cry蛋白的敏感性是否也存在差异对有效治理不同寄主田二化螟种群和延缓其抗药性意义重大。因此,本研究以二化螟水稻种群和茭白种群为对象,探究两寄主种群对3种Cry蛋白及5种常用化学药剂的敏感性差异,为不同寄主田防治二化螟时的药剂选择提供依据,并为二化螟抗药性治理提供一定的参考。

　　1材料与方法

　　1.1供试虫源

　　二化螟水稻种群2010年7月采集于武汉市蔡甸区水稻田(113°57′E,30°29′N),茭白种群2010年5月采集于武汉蔬菜所水生蔬菜张家湾实验基地茭白田(114°16′E,30°28′N)。室内实验证实采集到的两种群交配节律存在显着差异(未发表数据),而交配节律的差异是鉴定二化螟寄主种群的关键因素[3]。

　　两种群于养虫室内(温度(28±1)℃,相对湿度70%~80%,光周期L15∶D9)分别以主成分为水稻秆和茭白果肉的两种人工饲料饲养3代后,取第4代初孵幼虫和4龄幼虫用于后续实验。

　　1.2供试药剂
　　
　　供试药剂见表1。

　　1.3实验方法

　　1.3.1二化螟水稻种群和茭白种群4龄幼虫对5种杀虫剂的敏感性采用微量点滴法[11]分别测试两寄主种群4龄幼虫对5种杀虫剂的敏感性。以95%丙酮(杀虫单用V丙酮∶V水=1∶1的溶液)为溶剂,供测药剂设置5~7个浓度梯度。使用微量进样器(上海申安医疗器械厂所制,容积为1μL)吸取0.06μL药液点滴在二化螟幼虫的前胸背板上。每处理10头试虫,重复3次,设置丙酮或丙酮/水混合液为对照。药剂处理后将幼虫转移至上述饲养环境中饲养。

　　48h后统计毒死蜱、辛硫磷和氯虫苯甲酰胺处理组的幼虫死亡数,判别标准为针刺幼虫无自主性反应或幼虫身体变黑;96h后统计阿维菌素和杀虫单处理组的幼虫死亡数,判别标准为虫体发软或翻身后30s内不能翻转[10]。

　　1.3.2二化螟水稻种群和茭白种群初孵幼虫对Cry蛋白的敏感性采用人工饲料胃毒法[9]测试两种群初孵幼虫对Cry蛋白的敏感性。将Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca干粉分别用碳酸钠溶液(pH10.0)溶解后混匀制成母液。以蒸馏水作为溶剂,供试药剂均设5个浓度梯度,并分别与人工饲料充分混合均匀,置于10mL的离心管中。每管挑取10头初孵幼虫,重复4次。

　　以未添加Cry蛋白的人工饲料作为对照,6d后统计幼虫的死亡率,针刺无自主性反应时认为是死亡个体[9]。

　　1.4数据分析
　　
　　采用MicrosoftExcel软件计算校正死亡率、毒力回归方程以及LD50(LC50)95%置信区间等有关参数。以LD50(LC50)的95%置信限是否有重叠作为判断不同种群间药剂敏感度及同一种群对不同药剂敏感度差异是否显着的标准[8]。以毒力回归方程中的斜率作为判断种群同质性的依据。供试群体对药剂毒力回归线的b值越小,供试群体的异质性越大[8],即对该药的毒力反应个体之间差异较大,该供试群体对药剂产生抗药性越容易。相对毒力指数=[标准药剂LD50(LC50)×100/供试药剂LD50(LC50)]。

　　2结果与分析

　　2.1二化螟水稻种群和茭白种群

　　4龄幼虫对不同类型杀虫剂的敏感性通过比较两种群4龄幼虫对同一药剂的毒力回归方程斜率大小可知,水稻种群对毒死蜱和阿维菌素的异质性高于茭白种群,而对辛硫磷、氯虫苯甲酰胺和杀虫单的异质性低于茭白种群,说明水稻种群更容易对毒死蜱和阿维菌素这2种药剂产生抗药性;而茭白种群更容易对辛硫磷、氯虫苯甲酰胺和杀虫单这3种药剂产生抗药性(表2)。

　　两种群4龄幼虫对同一药剂的致死中量及其置信区间的实验结果表明:二化螟水稻种群4龄幼虫对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的敏感性显着低于茭白种群;对辛硫磷和毒死蜱的敏感性比茭白种群低,但差异不显着;二化螟水稻种群对杀虫单的敏感性比茭白种群高,差异未达到显着水平(表2)。

　　另外,本研究中,同一寄主种群二化螟4龄幼虫对几种类型杀虫剂的致死中量的置信区间均不重叠,且对不同药剂毒力回归线的b值均不同(表2),说明二化螟对不同杀虫剂的敏感性存在显着差异,对不同杀虫剂产生抗药性难易程度存在差异。水稻种群和茭白种群对不同杀虫剂的敏感性由大到小的次序均为:阿维菌素>氯虫苯甲酰胺>辛硫磷>毒死蜱>杀虫单。水稻种群对几种药剂产生抗药性由易到难顺序为:毒死蜱、阿维菌素、杀虫单、氯虫苯甲酰胺、辛硫磷;茭白种群对几种药剂产生抗药性由易到难顺序为:杀虫单、阿维菌素、氯虫苯甲酰胺、毒死蜱、辛硫磷。

　　2.2二化螟水稻种群和茭白种群初孵幼虫对Cry蛋白的敏感性表3为二化螟初孵幼虫对不同Cry蛋白的敏感性比较。通过比较两种群初孵幼虫对同一毒蛋白的毒力回归方程斜率大小可知,水稻种群初孵幼虫对Cry1Ac和Cry1Ca的异质性比茭白种群高,而对Cry2Aa的异质性比茭白种群低,说明水稻种群对Cry1Ac和Cry1Ca更容易产生抗药性,而茭白种群对Cry2Aa更容易产生抗药性。

　　两种群对同一药剂的致死中浓度及其置信区间的结果表明,水稻种群对Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca的敏感性与茭白种群有差异,但差异均不显着。同一寄主种群二化螟初孵幼虫对几种Cry蛋白的致死中浓度的置信区间均不重叠,且对不同Cry蛋白毒力回归线的b值均不同(表3),表明二化螟对不同Cry蛋白的敏感性存在显着差异,且对不同Cry蛋白产生抗性的难易程度存在差异(表2)。二化螟水稻种群和茭白种群对3种杀虫蛋白的敏感性由强到弱的顺序为:Cry1Ca>Cry1Ac>Cry2Aa;二化螟水稻种群和茭白种群对3种Cry蛋白产生抗药性由易到难顺序为:Cry1Ca、Cry1Ac、Cry2Aa。

　　3讨论

　　本研究表明,二化螟水稻种群和茭白种群对所测几种类型杀虫剂敏感性存在差异,且对同一药剂产生抗药性的难易程度也存在差异。因此,针对不同寄主田的二化螟种群应采用不同类型的药剂。相对于水稻田,茭白田二化螟种群适宜用较低含量的阿维菌素和氯虫苯甲酰胺来进行防治,可减少施药以达到防止农药过量以及减缓抗性发展的目的。另外,本研究表明,二化螟对不同类型药剂的敏感性存在显着差异,且对不同药剂产生抗药性的难易程度也存在差异。据此,田间防治二化螟时应尽量不使用单一药剂,可考虑采用药效最好的阿维菌素与其他几种药剂进行混配施用,既有增效作用,又能延缓二化螟对药剂产生抗药性的速度,延长杀虫剂的使用寿命。

　　二化螟水稻种群和茭白种群对同种杀虫剂的敏感性差异,可能是由于:

　　1)不同类型杀虫剂作用机理有差异;2)不同寄主植物对害虫抗药能力的诱导效果不同;3)两寄主种群酯酶同工酶存在差异,存在种下分化的可能。昆虫对杀虫剂敏感性变化与杀虫剂的作用机制存在一定关系。本研究证明二化螟寄主种群对阿维菌素和氯虫苯甲酰胺的敏感性存在显着差异,这可能是由于两种药剂的独特作用方式。阿维菌素是一种神经毒素,作用靶标为昆虫的γ-氨基丁酸受体(GABAR),也可作用于抑制性谷氨酸受体(IGluR),改变氯离子通道[12-13];而氯虫苯甲酰胺与鱼尼汀受体(RyRs)结合,高效激活昆虫鱼尼汀受体后,过度释放细胞内库中的钙离子[14],寄主植物可能引起相关受体的变化从而导致差异的产生。昆虫取食不同植物后对杀虫剂的敏感性会发生变化,这种现象已有报道[15-17]。昆虫对杀虫剂敏感性变化与寄主植物次生物质对昆虫体内解毒酶活性的诱导激活或抑制有关,诱导可能受到次生物质种类、含量、环境以及植物营养等影响,经过诱导,害虫的解毒酶对杀虫剂的代谢能力会发生变化[18-20],从而导致同种昆虫取食不同寄主后对同一药剂的敏感性产生差异。此外,前人研究二化螟对氧化杀螟松、杀螟硫磷等药剂的抗药性时,发现其抗药性机理与酯酶同工酶有关[2],而酯酶同工酶是昆虫分类的重要参考指标[21],二化螟水稻种群和茭白种群的酯酶同工酶存在差异[2]。因此,二化螟不同寄主种群药剂敏感性差异可能与二化螟存在种下分化有关,其内在机制有待进一步研究。

　　二化螟同一种群对不同Cry蛋白敏感性存在显着差异,对Cry1Ca的敏感性最高,Cry1Ac次之,Cry2Aa的敏感性最低。其原因可能是Cry1Ca、Cry1Ac和Cry2Aa的作用靶标位点存在差异,即其毒理机制存在一定差异[22-23]。因此,未来转基因水稻商业化种植时,可考虑研发双价或多价转基因水稻,获得更好的杀虫效果,起到延缓二化螟对Cry蛋白产生抗药性速度。

　　二化螟水稻种群对Cry蛋白敏感性和茭白种群相比存在一定差异。水稻种群对Cry1Ac和Cry1Ca更容易产生抗药性,茭白种群对Cry2Aa更容易产生抗药性。利用这一现象,在特定品种转基因水稻商业化种植时,茭白田可作为水稻田边二化螟的“庇护所”,从而起到减缓二化螟对Cry蛋白产生抗药性的速度,这一策略已在其他转基因作物中应用[24-25]。