血瘀证的动物模型与细胞模型研究(3)

　　2. 3血瘀证动物模型的评价
　　
　　中医辨证所遵循的是以外测内的思维方式，这决定了证候模型的认定依据应该与体征表现紧密联系[24],体征表现是血瘀证造模的核心。只有动物被诱导出与血瘀证相同的体表特征，如局部肿痛、眼结膜血管扩张充血、唇周发黑、耳廓唇周暗红、爪甲尾部紫暗、舌暗红等，才可以判定为血瘀证动物模型。
　　
　　血液流变学指标的变化是血瘀证造模的辅助判断。据研究观察，血瘀证患者往往存在微循环障碍、血流动力学障碍及血液流变学异常[25].1986年中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制订的血瘀证诊断标准[4]已将血液流变学变化作为其中一项指标。但这其中一项或几项指标异常并不能说明其就是血瘀证，因为其他证候也可出现，并不具有特异性，故只可作为辅助判别依据。
　　
　　以方测证是血瘀证模型成立的辅助判断方法，即依据方剂的功效或其组成药物的功效推测或反证其对应证候的属性[26].虽然以方测证被当作一种重要的研究方法在中医动物模型研究中广泛使用，但不可否认的是，目前这种研究方法没有比较标准的操作规范和适用范围，仍然受到争议。
　　
　　综上所述，血瘀证动物模型的评价方法必须以征象为主，指标为辅，二者相辅相成，共同成为评价血瘀证模型建立的标准。亦可参照血瘀证诊断标准量表，制定动物模型诊断量表，更进一步规范动物模型的制作。
　　
　　3血瘀证的细胞模型
　　
　　目前血管内皮细胞是血瘀证的主要细胞模型。《灵枢·经脉》云：“脉不通则血不流”,《灵枢·阴阳二十五人》云：“其结络者，脉结血不行，决之乃行”,提示脉的功能正常是保证血液循行正常的重要条件，脉的功能受损与血瘀证的发生有密切关系。中医学所认识的藏象是功能概念，中医之“脉”与现代医学之“血管内皮”虽不能等同，但在功能上有很大相关性。血管内皮作为血液与平滑肌之间的生理性屏障，在维持血液的正常流动中发挥着重要的作用。在内皮结构受损或功能紊乱时，体内可出现一系列与凝血和抗凝有关的连锁反应，进而影响血液的流变性，表现出“血瘀证”的特征。
　　
　　国内报道多用兔和大鼠，以牛血清白蛋白与去甲肾上腺素联合应用复制血瘀证细胞模型[27 - 29].根据造模方法和来源的不同，血管内皮细胞模型又可以分为血瘀证动物模型直接取材和损伤培养的正常细胞模型两大类[27 - 30].也有研究[31]观察血瘀证动物血清对血瘀证心肌细胞的影响。
　　
　　在对血瘀证特点的观察基础之上，有学者研究了血瘀证兔的内皮细胞作为血瘀证模型的可行性。复制去甲肾上腺素与牛血清白蛋白诱导的血瘀证兔模型，分离其主动脉血管内皮细胞进行原代和传代培养，检测模型动物体内血浆及体外细胞液中抗凝血和纤溶指标的变化，发现原代细胞中变化更为明显，而传代细胞中变化并没有显着性[27].
　　
　　如果传代细胞并没有显着特点的话，说明模型不容易复制，不是成熟的细胞模型，所以研究者又采用了血瘀证兔模型血清损伤培养血管内皮细胞的方法。发现这种细胞出现了病理性损伤及内分泌功能的改变，并且更易于复制，光镜和电镜都发现形态学有显着变化[28].而以药测证，血瘀证加中药组粗面内质网数目较少但不扩张，细胞表面微绒毛未见融合，细胞间隙增大不明显[29].
　　
　　另外，有学者提出利用血瘀证患者的血清损伤培养人脐静脉血管内皮细胞，探索建立一种病证结合的血瘀证血管内皮细胞损伤模型的方法[30].该方法符合中医自然发病因素，体现病证结合特点，又较为接近人类疾病的实际情况。实验采用高血压病血瘀证患者血清培养血管内皮细胞[32 - 33],观察其活性、形态、DNA及相关功能的影响。发现高血压病患者血清作用后的内皮细胞活性降低，发生氧化应激反应、细胞的损伤及内皮细胞损伤标志物内皮素 （ET）、血管性血友病因子 （v WF）、血栓调节蛋白 （TM） 的表达增加。
　　
　　在此基础上，学者通过血瘀证细胞模型探索“异病同治”的内涵[34].高血压病患者血清和糖尿病患者血清干预正常培养的人脐静脉内皮细胞都可以造成血管内皮细胞的损伤，在细胞形态和细胞活性、细胞内分泌功能等方面没有明显的差异，此为“证同”,可以作为血瘀证共同的病理生理学基础模型。而在“异病”方面，由于糖尿病和高血压病的血清也存在不同程度的差异，对细胞损伤的差异集中表现为细胞内分泌功能和细胞内钙离子的浓度变化等方面，这些差异可体现为“病异”的基础。前后结合后则明确体现了“异病同证”的特点。
　　
　　因为没有具体征象的表现，建立细胞模型较动物模型更为困难。目前主要应用血瘀证患者或动物血清损伤血管内皮细胞建立血瘀证细胞模型，其评价体系更为苛刻，考虑的因素也更多[35],主要包括细胞的生物学特性及其培养过程中受内外环境的影响； 造模因素是否符合临床实际，能否严格按照统一标准收集血清，临床执行是否有难度； 最佳的细胞接种浓度和培养基的血清浓度； 是否符合血瘀证临床表现及证候相关的关键物质的特征变化，如细胞活性、细胞形态及功能的改变； 探索病证模型的动态变化特征，寻找相对稳定的时相点； 考察模型的可重度性和稳定性，以最后确定模型的特点及适用范围。