大鼠重度心肌挫伤后HIF-1的染色变化观察

　　HIF - 1 是 缺氧诱导的 DNA 结合蛋白， 包括ARNT 和 HIF - 1α， 可 调 控 血 管 内 皮 生 长 因 子（ VEGF） 、促红细胞生成素 （ EPO） 、糖酵解酶等多种基因的表达，还可以通过 VEGF 和其他靶基因的连接控制许多缺氧的反应[1 -2].

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料

　　1. 1. 1 实验动物及分组 健康成年 Wistar 大鼠 36 只（ 由山西医科大学实验动物中心提供） ,不限雌雄，体重 （ 292 ±4） g,随机将大鼠分为损伤组 （ 48 只）和对照组 （ 8 只） ,损伤组分为 6 组： 6 h 组、12 h组、24 h 组、2 d 组、4 d 组、6 d 组，每组 8 只； 对照组分为死后损伤组和正常对照组，每组 4 只[3].

　　1. 1. 2 试剂 HIF - 1 蛋白多克隆抗体，枸橼酸缓冲液，抗体稀释液，PBS,免疫组化试剂盒等均为Boster 生物工程有限公司生产。

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 大鼠进行处死，固定取材，处理组织[3]

　　1. 2. 2 免疫组织化学染色 把各组损伤区的心肌组织制成的腊块切成厚度为 3 μm 的切片，脱腊，用3% H2O2 浸泡 10 min,再用蒸馏水清洗 2 min,共 3次。用装有枸橼酸盐缓冲液的容器浸泡切片，加热，使装有枸橼酸盐缓冲液的容器的液体温度保持在 92~ 98 ℃ ,10 min 后室温条件下冷却。使用 PBS 冲洗，依照免疫组织化学试剂盒说明书进行 SABC 法染色。阳性对照用厂家提供对照切片，空白对照以 PBS 替代第一抗体。

　　1. 2. 3 图像分析及统计学处理 应用 BI - 2000 图像分析系统对各组切片进行定量分析。每张切片操作如下： 在心肌挫伤区域附近随即选取周围 5 个高倍视野（ 放大倍数 ×200,观察窗面积 120 960 um2） ,计算一定面积内阳性信号面积占所测定面积的比例，测算阳性指数 （ PI） ,PI 的计算方法为： 阳性信号平均灰度值 × 阳性信号面积与测定面积的比值； 比较对照组、实验组以及各实验组之间的所得数据。应用 SPSS10. 0 软件包对实验组各时间段的比值进行方差分析，数据以均数 ± 标准差 （ （ x-± SD） 表示[3].

　　2 结 果

　　2. 1 常规 HE 染色 观察正常对照组，发现心肌细胞染色清楚，细胞核浓染致密。观察实验组，从挫伤后 6 h 开始，发现挫伤灶中心区多数呈现坏死，挫伤灶周围区域心肌细胞充血肿胀，嗜酸性染色增加明显，心肌间质广泛出血，红细胞散在分布于心肌纤维间，伴有淋巴细胞、中性粒细胞浸润和心肌纤维断裂。24 h 后观察发现，心肌纤维间隙出现大量多形核白细胞浸润。打击后 6 h 观察，心肌间仍可见到散在的红细胞。

　　2. 2 免疫组织化学染色与图像分析及统计学处理镜下观察，正常对照组和死后损伤组均为阴性表达。观察实验组，在挫伤灶周围可见阳性细胞，细胞浆内可见染为棕黄色的颗粒。阳性表达出现在大鼠打击心脏后 6 h,并且随着时间的推移阳性细胞逐渐增多，细胞免疫反应性逐渐增强，细胞表达的部位变化的规律是由细胞周边逐步向中间扩展，致伤后 2 d 达到高峰，以后免疫反应性逐渐减弱 （ 见封四图 1 -6） .

　　2. 3 HIF - 1α 的图像分析 （ 见表 1）

　　3 讨 论

　　3. 1 HIF - 1α 和心肌挫伤 在常氧情况下，细胞的HIF - 1αmRNA 和蛋白表达水平很低。在缺氧 （ 1%O2） 情况下，HIF - 1α mRNA、蛋白可在人、大鼠和小鼠的各种组织和器官内广泛表达。胸部在受到双向应力作用、直接应力作用、减速力作用、血管内应力显著升高等时，可直接损害心肌细胞。这是因为心脏的压缩变形使心脏内压力瞬时升高，心室两侧形成高速、过度扩张变形区域，造成心肌纤维的部分撕裂甚至心脏的破裂。胸部受到撞击，心脏被大幅度扭曲，心肌组织受到剪切力作用，经检测肌钙蛋白 -1 的水平较高，因此证明心肌受到了直接损害[4],这是 CC的主要因素。

　　蔡建辉[5]等还发现，重度心肌挫伤后全身表现应激反应，血管内皮受到损伤，红细胞压积、全血粘度（ ηb） 、血浆外渗等使血浆纤维蛋白原 （ Fib） 升高，进一步证实了心肌受到重度挫伤后表现为高粘滞血症，通过正反馈方式扩大，使缺氧、缺血更为严重[6].

　　从本实验的结果得知，死后损伤组和正常对照组免疫反应为阴性。心肌挫伤后 6 h 开始表达，高峰出现在 2 d 后，此后呈现下降趋势，到 6 d 表达轻微，说明重度心肌挫伤后 6 h 开始，直到 6 d 挫伤灶周围组织呈现缺氧状态。缺氧激活 HIF -1 的 DNA 结合活性，启动含基因序列的表达[7 -8].但是 HIF -1α 的表达对心肌挫伤是否还具有保护作用，目前仍不清楚[9].

　　HIF - 1α 在受伤后较早开始表达，并能保持持续的时间，尤其在表达的时程与强度上均有明显规律性，并且时相上表现不一。这些都充分证明了心肌挫伤后能诱发 HIF - 1α 的表达。HIF - 1α 的检测可粗略推断心肌挫伤后损伤时间，可作为推断心肌挫伤经过时间的参考指标[10].

　　3. 2 HIF - 1α 在法医学中的应用前景及展望 本研究首次把 HIF - 1α 在大鼠心肌挫伤后心肌细胞的表达作为重度心肌挫伤后损伤时间的推断指标，具有一定的现实意义。同时，HIF -1α 的心肌损伤前和死后不表达这一特点，对于鉴别生前伤和死后伤也具有重要意义，因此在法医学中有良好的应用前景。

　　参 考 文 献

　　[1] Koch AE,Reinders BP,Smeets TJ,et al. Angiogenesis as a target inrheumatoid arthritis [J] . The Annals of the Rheumatic Diseases,2003,62 （ Suppl2） : 60 - 67.

　　[2] Knudsen AR,Kannerup AS,Mortensen FV,et al. Effects of ischemic pre- and postconditioning on HIF - lα，VEGF and TGF - B expression afterwarm ischemia and reperfusion in the rat liver [J] . Comparative Hepatolo-gy,2011,10 （ 1） : 3 -9.