分析主动免疫GTD对SD雌鼠生殖功能的影响,动物学论文

论文摘要

　　促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是由下丘脑合成并释放的十肽激素，通过垂体门脉系统作用于垂体前叶的GnRH受体，促使垂体合成并释放促黄体激素(Luteotropic hormone，LH)和促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)，在性腺生长发育以及生殖过程中起重要调节作用。外源GnRH主动免疫，能刺激动物机体产生大量抗GnRH特异性抗体，引起生殖内分泌系统失衡，从而改变下丘脑－垂体－性腺轴的正常反馈调节关系，减少生殖激素的合成和分泌，致使被免疫动物性腺萎缩、重量减轻，并降低配子质量，终止配子发育，使生殖功能降低甚至消失，达到去势效果。在畜牧业生产中，GnRH免疫去势可去除猪肉中由雄烯酮引起的“膻味”;减少公猪、公牛、公羊间的攻击性行为、提升肉质品质;也可消除母畜性成熟后周期性发情造成的无计划怀孕对育肥效果的影响;免疫去势还能避免外科阉割给动物带来的应激、感染等不利影响，也符合日趋合法化的动物福利的要求，具有良好的市场前景。

　　而动物经GnRH主动免疫后，调控信号如何到达下丘脑－垂体－性腺轴?下丘脑－垂体－性腺轴又如何发挥作用调控动物的生殖状态从而达到去势效果?

　　关于这一问题，最早由Meloen等提出理论上可能存在的多方面因素;后逐渐形成3种假说:“免疫中和假说”、“GnRH合成/分泌下调假说”以及“GnRH受体表达下调假说”。另外，由于GnRH主动免疫通过打破生殖轴的正常反馈调节关系，使其长期处于动态失衡状态，因此，研究下丘脑－垂体－性腺轴与激素分泌之间的调控关系有助于厘清GnRH主动免疫的机理，但相关研究鲜有报道。本研究以SD大鼠为模型，动态研究GnRH主动免疫对SD大鼠生殖激素分泌以及下丘脑－垂体－卵巢轴相关生殖基因表达的影响，以探讨GnRH主动免疫去势的分子机理。

　　1、材料与方法

　　1.1主要试剂和仪器

　　GnRH并列二聚体卵清蛋白复合物(GTD-OVA)本实验室合成。FSH、LH、P4、E2放射免疫试剂盒(北京北方生物研究所);反转录试剂盒Prime ScriptRTreagentkitwithg DNA Eraser ( Perfect Real Time)(大连宝生物公司);GC－911惴派涿庖呒剖中国科大中佳公司)，CFX96 Touch荧光定量PCR仪(BIO-RAD，Inc．美国)

　　1.2试验动物选取及处理

　　选取10周龄体重180～220g的健康性成熟SD雌鼠48只，随机分为GnRH免疫去势组和空白组，每组24只(各组再随机分为3个小组，n=8)。疫苗制备参照Oonk等方法进行。将以D型赖氨酸(D-lysine)取代6位甘氨酸(Glysine)的GnRH并列二聚体卵清蛋白复合物(GTD-OVA)溶于PBS(pH值7.4)中，与Specol佐剂充分乳化。12周龄时，免疫去势鼠腿部肌肉注射1mL疫苗(含GTD50靏)，4周后加免，注射剂量及方法同初次免疫。空白组不做任何处理。试验期间所有动物按常规标准分笼饲养，每笼3只，自由采食和饮水。

　　1.3样品采集

　　初次免疫当天记为0wpv(Weeks post vaccination)。加免后第4、6、8、10、12周(即8、10、12、14、16wpv)空腹尾尖采血1次，每次1.5mL，直至处死。所有血样于4℃放置过夜，3500r·min－1，4℃离心15min，分离血清，－20℃保存用于测定血清激素含量。

　　各小组雌鼠分别于加免后4、8、12周(即8、12、16wpv)眼球采血后断颈处死，收集血液;迅速分离双侧卵巢，剔除其脂肪组织后精确称重。迅速分离下丘脑、垂体、卵巢液氮速冻，－70℃保存，用于测定相关基因mRNA表达水平。

　　1.4血清激素含量测定

　　应用放射免疫分析(RIA)法测定血清中FSH、LH、孕酮(Progesterone，P4)和雌二醇(Estradiol，E2)含量。操作步骤按试剂盒说明书进行。FSH放射免疫分析药盒灵敏度＜1.0mIU·mL－1，精密度:批内＜10%、批间＜15%;LH放射免疫分析药盒灵敏度1.0mIU·mL－1，精密度:批内＜10%、批间＜15%;P4放射免疫分析药盒灵敏度0.2mIU·mL－1，精密度:批内＜10%、批间＜15%;E2放射免疫分析药盒灵敏度＜2mIU·mL－1，精密度:批内＜10%、批间<15%。

　　1.5基因表达测定

　　使用苯酚－氯仿法提取各组织总RNA，电泳检测其完整性。完整RNA利用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板在特定引物下进行定量检测。95℃预变性10s后接着按以下程序进行PCR:

　　95℃变性5s，58～61℃退火+延伸25s，40个循环，最后进行溶解曲线分析以检测PCR扩增产物的特异性，每个样品3次技术性重复。目的基因mRNA相对表达水平采用标准曲线法进行计算。引物序列见表1。

　　1.6数据处理

　　利用SPSS20.0软件对所测数据进行单因子方差分析，采用独立样本t检验进行数据间比较，结果以平均值±标准误(mean±SEM)表示。p＜0.05表示数据差异显着。

　　2、结果与分析

　　2.1卵巢发育以及卵巢质量变化

　　GTD主动免疫雌鼠后，卵巢体积减小。采样时观察，卵巢变小、严重皱缩(图1为16wpv采样时免疫组和空白组生殖器官)。

　　【图1】【表1】

　　如表2所示，GTD主动免疫雌鼠，直至处死，其卵巢质量持续减小，3个采样时间免疫组卵巢平均质量分别为空白组卵巢平均质量的63.63%、38.46%和21.43%，均差异显着(p＜0.05)。试验结果表明注射GnRH免疫去势疫苗能阻碍卵巢发育，显着降低卵巢质量。

　　【表2】【图2】

　　2.2血清激素含量

　　2.2.1血清FSH含量血清FSH含量见图2－A，整个试验期间空白组雌鼠血清FSH浓度维持平稳，波动范围为1.58～1.70mIU·mL－1，平均浓度1.65±0.026mIU·mL－1，免疫组雌鼠血清FSH浓度也相对平稳，在1.29～1.51mIU·mL－1范围内小幅波动，平均浓度为1.39±0.041mIU·mL－1。两平均浓度差异显着(p＜0.05)。

　　2.2.2血清LH含量如图2－B所示，免疫组和空白组雌鼠血清LH浓度都相对稳定，波动范围分别为0.781～0.900mIU·mL－1和0.273～0.303mIU·mL－1，平均浓度分别为0.286±0.005mIU·mL－1和0.834±0.022mIU·mL－1;二者差异显着(p＜0.05)。

　　2.2.3血清P4含量如图2－C所示，空白组雌鼠血清P4浓度整个试验期间维持在8.365～11.74ng·mL－1，而免疫组雌鼠血清P4从加免后开始持续下降，直至处死。从加免后第6周(即10wpv)开始，各时间点免疫组雌鼠血清P4含量均显着低于空白组(p＜0.05)。

　　2.2.4血清E2含量如图2－D所示，空白组雌鼠血清E2含量整个试验期间维持在4.320～5.337pg·mL－1范围内。与P4含量变化情况相似;而免疫组血清E2含量从加免后开始持续降低，直至处死。从第10wpv开始，各时间点免疫组雌鼠血清E2含量均显着低于空白组(p＜0.05)。

　　综上，经GTD去势疫苗主动免疫后，雌鼠血清FSH含量受影响较小，LH、P4和E2含量均显着下降。

　　2.3下丘脑－垂体－卵巢轴生殖基因mRNA表达变化。

　　GTD主动免疫对下丘脑GnRH和ER－醡RNA表达水平的影响如图3所示。与对照组相比，GTD主动免显着下调ER－醡RNA表达水平，而对GnRHmRNA的表达水平的下调试验后期才表现出来(p＜0.05)。

　　GTD主动免疫对垂体GnRH-R、FSH－饧癓H－鈓RNA表达水平的影响如图4所示。与空白组相比，GTD主动免疫显着下调垂体GnRH-R、FSH－饧癓H－鈓RNA表达水平(p＜0.05)。

　　GTD主动免疫对卵巢LH-R、FSH-R及ER－醡RNA表达水平的影响如图5所示。与空白组相比，GnRH主动免疫显着下调卵巢LH-R、ER－醡RNA表达水平(p＜0.05)，但对FSH-RmRNA表达水平的影响直到加免后12周(即16wpv)才开始呈现显着(p＜0.05)。

　　综上，GTD主动免疫对雌鼠生殖相关基因mRNA的表达调控有不同影响，除下丘脑GnRHmRNA先小幅升高至于空白组，然后下降外，其余基因的mRNA均显着低于空白组。

　　3、讨论

　　虽然GnRH主动去势疫苗在农业生产上有很好应用的前景，但其去势机理尚不明确，这也许是该疫苗未能广泛生产使用的根本原因。因此，阐明GnRH主动去势的机理，突破相关技术瓶颈，有望扭转我国某些技术和产品依赖进口的局面;有助于打破国外企业垄断，保障我过养殖产品有效供给和养殖业健康可持续发展。本研究从表观到分子层面系统研究了动物经GnRH主动免疫去势后下丘脑－垂体－卵巢轴的动态变化，以阐明GnRH主动免疫去势的机理。

　　使用外源GnRH主动免疫动物，能明显引起性腺萎缩。本研究结果同样显示，GTD主动免疫雌鼠后，卵巢质量明显下降，至处死时仅为空白组大鼠卵巢质量的23%。解剖时观察，卵巢变小、严重皱缩。

　　许多研究结果表明，接受GnRH主动免疫的动物其血清促性腺激素及性激素浓度均有降低。【图3】【图4】【图5】

　　研究也得到相似结果:GTD主动免疫雌鼠后，血清FSH、LH、P4及E2含量与空白组相比显着下降(p＜0.05)，这与GnRH主动免疫动物的研究结果一致。P4和E2是由卵巢分泌的重要孕激素和雌激素，负责调节雌性特征、附属性器官的成熟和月经－排卵周期等。本研究中免疫雌鼠血清P4和E2含量均显着低于空白组，显示达到了很好的免疫去势效果。另外，E2含量的下降也对下丘脑水平生殖相关基因的合成产生影响。

　　本研究显示，GTD主动免疫后，下丘脑GnRHmRNA的表达先小幅升高后降低，而ER－醡RNA表达量持续下降。在本研究中，免疫去势大鼠体内雌激素P4和E2含量显着下降，原因也许是“衰老”造成的。翁祖星等进行以下研究:将雌性大鼠摘除双侧卵巢，20d后处死取下丘脑称重，发现摘除卵巢的雌性大鼠下丘脑重量显着低于空白组的(p＜0.05)，他们推测其原因是:卵巢摘除后的雌性动物体内缺乏雌性激素，类似于“衰老”，在这一“衰老”过程中，动物体内与免疫、内分泌功能相关的器官重量会逐渐减轻，下丘脑也出现了这一变化，继发性造成内分泌激素含量下降。同时，ER－醡RNA表达量下降，在下丘脑形成更少的激素(E2)－受体(ER)复合物，对GnRHmRNA在下丘脑的合成产生负反馈调控，刺激下丘脑GnRHmRNA的合成与表达。因而在试验采样初期，下丘脑GnRHmRNA表达量小幅上升。试验后期，下丘脑ER－醡RNA表达量继续下降，显着低于空白组(p＜0.05)，这是由于E2水平显着降低，造成“相对闲置”

　　的雌激素受体降解，此时形成的激素(E2)－受体(ER－复合物的浓度有可能低于“阈值”而不能负反馈引起GnRHmRNA在下丘脑的合成，造成GnRHmRNA表达下降;而此刻，之前由负反馈调控产生的多余的GnRHmRNA可能合成了GnRH，这也验证了Clarke等等的推论，合成的GnRH可能造成下丘脑质量在试验后期升高。这一结果符合“GnRH合成/分泌下调假说”，即下丘脑GnRHmRNA表达量下调，继而造成GnRH合成/分泌下降，影响了促性腺激素和性激素的合成和分泌，造成动物免疫去势。

　　GTD主动免疫后GnRH-RmRNA、LH－鈓RNA及FSH－鈓RNA表达水平显着下调，这与前人研究结果一致。下丘脑正中隆起分泌的GnRH通过垂体门脉系统到达垂体前叶与GnRH-R结合产生生物学效应，刺激FSH和LH的合成和释放。有研究表明，对大鼠使用GnRH拮抗剂会下调垂体GnRH-RmRNA的数量;另外，LopotM等学者给母羊第三脑室灌注GnRH，观察到腺垂体中GnRHmRNA含量升高。

　　这些试验结果说明垂体GnRH-RmRNA的数目的稳定维持需要GnRH激素参与，原因是GnRH的存在能够刺激GnRH-RmRNA的表达或增加GnRH-RmRNA结构的稳定性。本研究中GnRH-RmRNA表达量下调，根据以上可推论出下丘脑GnRH含量有所降低;并且，GnRH-RmRNA表达量下调提示可能造成GnRH-R合成减少。由于GnRH和GnRH-R的含量均下降，形成的有活性的配体－受体复合物数量也相应减少，切断了传向垂体的生殖信号，暗合“GnRH受体表达下调假说”。垂体的LH－鈓RNA及FSH－鈓RNA的表达受到GnRH脉冲方式的调控，GnRH通过激活磷脂酶C－磷酸肌醇－蛋白激酶C(PKC)信号传导通路，最终激活LH－鈓RNA、FSH－鈓RNA基因表达。由于缺乏GnRH信号的“指令”，垂体的LH－鈓RNA及FSH－鈓RNA的表达也随之降低。

　　卵巢ER－醡RNA表达呈下降趋势，并显着低于空白组(p＜0.05)。从ER－嵩诼殉卜⒂械牡骺刈饔每矗嬖谟诼涯赶赴械腅R－嵊氪萍に亟岷虾蠊瓜蠓⑸浠婧笥氪萍に厥芴宸从υ岷希苯踊蚣浣佑胱计鹗家蜃咏岷希纬晌榷ǖ淖计鹗几春衔铮舳肌４彻鄣闳衔珽R－嵬ü谋浠虻淖蓟疃吹鹘诼涯赶赴姆⒂统墒臁?

　　这一作用机制可以解释为何卵巢ER－醡RNA表达量随卵巢质量减轻而下降:雌鼠经免疫去势后，卵巢发育受阻，卵巢中卵母细胞数量下降，导致存在于卵母细胞的ER－岷克嬷陆担计鹗几春衔锖拷档停璋殉卜⒂佣鳨2合成下降;另一方面，外周雌激素水平能调节雌激素受体的表达，研究表明，E2可刺激ER－醡RNA的基础转录活性，这一现象不仅表现在卵巢E2和ER－醡RNA，还广泛表现在其他组织，如骨组织中E2对ER－醡RNA也存在正向调控作用，以及血管肌细胞中睾酮和其受体mRNA也存在相似现象，这可解释为在有靶物质存在的条件下，激素正向调控其受体mRNA的表达。

　　在本研究中，E2含量下降正反馈作用于其ER－醡RNA，下调其表达。

　　此外，GTD主动免疫显着下调了卵巢FSH-RmRNA和LH-RmRNA的表达(p＜0.05)，这与前人研究结果一致。有研究发现给GnRH主动免疫后的母猪注射孕马血清促性腺激素或是含LH和FSH的垂体提取液，均不能诱导卵巢E2合成和维持卵泡发育;孕激素处理后，给GnRH主动免疫后的绵羊多次注射eCG和GnRH类似物也未能诱导其排卵，由此可推断GnRH主动免疫通过下调卵巢FSH-RmRNA和LH-RmRNA基因表达，降低卵巢FSH-R和LH-R数量，在性腺水平减弱甚至阻止FSH和LH对性腺自身发育的作用，达到去势效果。

　　4、结论

　　GTD主动免疫抑制动物生殖内分泌激素的分泌，同时下调下丘脑－垂体－性腺轴生殖相关基因以及其受体mRNA的表达，在生殖轴各水平进行系统地正负调控，影响动物生殖功能，达到去势目的。