研究围孕期母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育的影响

　　前言
　　
　　叶酸（folate）是在绿叶蔬菜、谷物和动物肝脏中发现的一种 B 族维生素，主要参与 DNA 合成和甲基化过程，对胎儿的生长发育至关重要。近年研究发现， 母体低叶酸水平可能会增高胎儿宫内发育迟缓（Intrauterine Growth Retardation, IUGR）的发生率,但其分子机制尚不清楚；以往动物模型的研究提示叶酸缺乏会引起胎鼠重量下降,但也没有对其进一步的机制探讨。

　　目前认为，IUGR 的病因是多种因素作用的结果， 其病因学包括环境因素和遗传因素。现今很多研究证实胰岛素生长因子（insulin-like growth factor, IGF）、瘦素（leptin）、葡萄糖转运蛋白（Glut）及凝血因子Ⅳ等与胎儿 IUGR 密切相关.胰岛素或IGF 分泌和功能的异常，是目前研究的热点.IGF 是生长发育所必需的、起重要作用的生长调节因子， 是胎儿出生前和出生后生长的主要刺激物，与婴儿出生体重密切相关.IGF 系统包括胰岛素生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、胰岛素生长因子Ⅱ（IGF–Ⅱ）、胰岛素生长因子受体Ⅰ（IGF-ⅠR）、胰岛素生长因子受体Ⅱ（IGF–ⅡR）、胰岛素生长因子结合蛋白 1（IGFBP-1）和胰岛素生长因子结合蛋白 3（IGFBP-3）等，IGF-Ⅰ、IGF–Ⅱ结构类似于胰岛素，是重要的促分裂素，影响细胞生长和代谢，并通过自分泌、旁分泌和内分泌方式影响细胞增殖和分化，调节机体的生长发育.近期有研究表明，叶酸缺乏会导致孕鼠血清和孕18 天胎鼠颅骨中 IGF-1 蛋白含量降低;韩国 Kim HW 的一项研究也表明雄鼠叶酸缺乏会导致子代胎鼠脑中 IGFⅡ的表达量下降,这说明叶酸缺乏可能会影响 IGF 系统相关基因的表达水平。

　　本实验通过建立叶酸缺乏孕鼠模型，研究围孕期母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育的影响，并在叶酸主要存储器官肝脏组织中测定了 IGF 系统相关基因表达水平，进而对叶酸缺乏致胚胎异常发育的机制进行了初步的探讨。

　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料
　　C57BL/6J 清洁级雌性成年小鼠 12 只购自中国医科院实验动物中心，饲料配方中的氨基酸、维生素等购自美国 Sigma公司。实时荧光定量 PCR 仪（7500 fast） 为 ABI 公司产品；Nan-odrop 1000 分光光度计为 Thermo Scientific 公司产品；引物自上海生物工程技术有限公司合成；荧光染料 SYBR Green I 购自康为世纪公司；RNA 提取试剂盒购自美国 QIAGEN 公司；RNA 反转录试剂盒购自美国 Invitrogen 公司。

　　1.2 方法
　　1.2.1 动物模型的制备 健康清洁级未经产的成年 C57BL/6J 雌鼠 12 只，12 周龄，体重 19.1-21.2 g.按体重排序，随机分为正常对照组（Control）和叶酸缺乏组（FD）两组，每组 6 只。对照组小鼠喂养饲料以 AIN-93G 标准饲料配方为基础，其中氨基酸、矿物质和维生素混合物按 Bills N.D.等人建立的氨基酸限定配方进行调整；叶酸缺乏组小鼠喂养饲料是在对照组基础上剔除掉叶酸，具体成分详见表 1.两组小鼠皆自由进水和饮食，所有雌鼠先饲养于普通塑料笼具内单笼喂养，4 周后与正常成年C57BL/6J 雄鼠 1:1 合笼交配。每日下午 17:00 合笼，次日清晨检查阴栓，阴道口有乳白色或黄色凝固物者为见栓，记为 E0.5d,后转入普通饲养笼中，继续喂饲各自饲料直至取材。本研究使用的动物由实验动物使用与管理委员会审查许可（编号：IL-AS-PL-2012-001）。【表1】

　　
　　1.2.2 实验记录及取材 每周用电子天平称量雌鼠体重，准确至小数点后一位数。取材时间为孕 13.5 天（13.5 dpc）当天的 8:00~10:00,记录孕鼠每窝总胎数、活胎数、吸收胎数和死胎数；测量记录胎盘重量、胎鼠重量、胎鼠体长。计算并统计胎鼠 IU-GR 比率，以正常对照组胎鼠平均出生体重减去该组标准差的2 倍为基准，胎鼠重量小于或等于此标准者评定为 IUGR.取13.5 dpc 胎鼠肝脏组织，每一窝胎鼠的组织放入同一个冻存管中，液氮速冻，-80℃冰箱保存。

　　1.2.3 实时荧光定量 PCR 称取 13.5 dpc 小鼠胚胎肝脏组织 20mg,每组各 6 个标本，采用离心柱法提取总 RNA,Nanodrop1000 分光光度计测总 RNA 浓度。采用 Real-time PCR 法检测肝脏组织中 IGFⅠ、IGFⅠR、IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR、IGFBP-1 和 IGF-BP-3 mRNA 的水平，引物序列见表 2.Real-time PCR 反应体系20 μL,扩增反应条件为：50 ℃ 20 s、95 ℃ 10 min 后，以 95 ℃15 s、60 ℃ 1 min 循环 40 次，每份样本做三个重复孔。采用与内参基因 Gapdh 比较的△△CT 法计算 IGF mRNA 的相对表达量。【表2】

　　
　　1.3 统计学处理采用 SPSS 16.0 软件，数据以± SEM 表示，组间计量资料的比较采用独立样本 t 检验，吸收胎与死胎的比率、IUGR 发生率的比较采用 X2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果
　　
　　2.1 两组雌鼠体重的变化
　　随机分组的两组雌鼠的初始体重没有统计学差异（P>0.05），在分别饲以相应饲料后，与正常对照组相比，叶酸缺乏组雌鼠合笼前四周体重每日的增长量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而孕后至取材时的雌鼠体重每日的增长量两组间没有差别（P>0.05）（表 3）。【表3】

　　2.2 两组孕鼠吸收胎和死胎发生率的比较
　　在 13.5 dpc 取材时叶酸缺乏组的胎鼠总数为 51 只，其中吸收胎 14 例；正常对照组的胎鼠总数为 54 只，其中吸收胎 3例，死胎 3 例；与对照组相比，叶酸缺乏组吸收胎和死胎率升高1.47 倍，X2检验结果显示，两组差异具有统计学意义（P<0.05） （表 4）。【表4】

　　
　　2.3 胚胎发育评价及 IUGR 发生率的比较
　　两组孕鼠（每组 6 只）解剖结果发现，叶酸缺乏组有 37 例活胎，正常对照组有 48 例活胎，为两组间胎鼠的形态对比图，可见叶酸缺乏组胎鼠体型偏小。与对照组相比，叶酸缺乏组平均胎鼠重量显着降低，是正常对照组胎鼠重量的 74.06 %,差异具有显着性（P<0.01）。计算统计两组间胚胎 IUGR 的发生率，分析发现叶酸缺乏组显着高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.001）。胎盘重量和胎鼠顶臀长分析结果显示叶酸缺乏组略低于正常组，但没有统计学差异（P>0.05）（表 5）。【表5】

　　
　　2.4 胎鼠肝脏 IGF 系统基因相对表达量变化
　　胎鼠肝脏标本中 IGF 系统 mRNA 的相对表达水平分析结果显示，叶酸缺乏组 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR mRNA 水平均低于正常对照组，分别降低 58.45 %和 32.64 %,且两组间差异有统计学意义（P<0.05）；相反，IGFⅠ、IGFⅠR、IGFBP-1 和 IGFBP-3 的mRNA 相对表达水平，两组间没有统计学差异（P>0.05）。

　　3 讨论
　　
　　3.1 叶酸缺乏与胚胎发育叶酸作为一种水溶性维生素，参与 DNA 的合成与甲基化，对细胞的生长至关重要，近年来很多文献报道发现叶酸和胎儿发育关系密切。Sram RJ和 Relton CL 等人发现在早期妊娠的孕妇和新生儿中，有吸烟习惯的孕妇叶酸水平降低，且新生儿体重普遍偏低，两者高度相关。巴基斯坦的 Lindblad B发现IUGR 组母血和脐血中叶酸的水平是正常对照组的一半；澳大利亚的 Furness D 学者发现妊娠 18-20 周、发生 IUGR 的孕妇中，红细胞叶酸水平低于对照组，同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）高于对照组，并且在淋巴细胞可见 DNA 损伤的标志 - 微核和核质桥现象增多，这表明在妊娠中期母体的低叶酸和高Hcy 水平与 IUGR 相关。印度的 Gadhok AK通过采集妊娠晚期 150 名 IUGR 和 30 名正常孕妇的血样，比较 Hcy、叶酸和VB12 的水平，发现 IUGR 组孕妇血清 Hcy 的浓度高于对照组，而叶酸和 VB12 的浓度低于对照组。国内的蔡卫华分别研究了不同孕期的 IUGR 孕妇，发现 IUGR 组各孕期红细胞叶酸水平均低于对照组，且新生儿体重与母血红细胞叶酸水平密切相关。综上所述，妊娠早期、中期、晚期孕妇自身的低叶酸水平都会导致新生儿 IUGR 的发生率上升。

　　叶酸缺乏动物研究结果也发现，低叶酸饮食母鼠的怀孕率降低，孕鼠的孕期体重增加减少，孕鼠宫内活胎数减少，吸收胎、死胎比率增加，胎鼠重量下降，而大部分活胎的大体形态学都显示正常.Xiao S 等建立的叶酸缺乏模型是在饲料中添加 0.033 mg/kg、0.066 mg/kg、0.132 mg/kg 等不同含量的叶酸，并且加入 1 %的琥珀磺胺噻唑（ss）以抑制肠道叶酸的合成，膳食干预 8 周后合笼。Heid、Burgoon 等建立模型的方法与前者类似，不同的是在小鼠合笼前分别膳食干预 5 周和 4 周.本实验中叶酸缺乏组小鼠采用剔除叶酸的饲料配方，以控制外源性叶酸的摄入；并且为了最大程度地模拟孕妇在围孕期的低叶酸状态，并且便于独立评价叶酸缺乏对胚胎发育的不良作用，本实验并未采用 ss 肠道抑制剂，以排除其对胚胎发育的潜在影响。小鼠胚胎的器官形成期为第 10-14 天，因此我们选择13.5 dpc 器官形成的末期来观察叶酸缺乏对中孕期胚胎发育的影响。Bills N.D.等曾采用此方法成功建立了叶酸缺乏的小鼠模型，干预 5 周后发现小鼠体重、肝脏和红细胞等的叶酸含量都明显下降。廖国仪等人也采用类似方法建立了叶酸缺乏的孕鼠模型，通过孕前干预 2 周，发现孕晚期（E20 d）胎鼠的平均体重、鼻 - 臀长、脑重均低于对照组。本实验中雌鼠妊娠结局与上述文献结果一致，叶酸缺乏组雌鼠合笼前体重增长下降，孕鼠中吸收胎和死胎比率升高，胎鼠重量低于正常对照组，这说明在小鼠的孕中期，叶酸缺乏引起的胎鼠发育受限就已经得到了体现。以往实验虽表明叶酸缺乏会导致胎鼠重量下降，但均未严格的采用 IUGR 判定标准计算比率，本实验采用标准差法首次描述并判定了叶酸缺乏致小鼠胚胎 IUGR 的发生率。

　　3.2 IGF 表达与 IUGRIGF
　　系统包括两种配体（IGF-Ⅰ， IGF-Ⅱ），两种受体（IGF-ⅠR, IGF-ⅡR）、六种 IGF 结合蛋白（IGF-binding proteins, IGFB-Ps）、IGFBP 相关蛋白 （IGFBP-related proteins, IGFBP-rPs） 和一组 IGFBP 蛋白酶.IGFs 在局部组织环境中通过自分泌和 （或）旁分泌机制，配体和受体相结合，激活下游效应因子，发挥促有丝分裂作用， 并可诱导细胞分化和促进许多细胞分化后功能表达。IGFBPs 是与 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ有高结合力的一组蛋白，循环中 IGFs 的浓度随着 IGFBPs 的变化而变化，它们是 IGFs 生物功能的调节剂，能将 IGFs 转运并定位到特定的细胞中，延长循环中 IGFs 的半衰期以调控其促生长活性，其中 IGFBP-3 在血中的含量最高，是 IGFs 的主要载体蛋白，IGFBP-1 也能快速调节血浆中 IGFs 的活性， 并可在细胞水平上调节 IGFs 的物质.研究表明，IGFs 是调节胎儿生长发育的重要物质之一，亦是控制胎儿生长有效的有丝分裂素.由于肝脏是动物中叶酸存储和代谢的主要器官,也是产生 IGFs 的主要器官，所以我们选取胎鼠肝脏标本为研究对象，探讨 IGF 系统基因的表达变化。

　　IGF-Ⅱ是重要的胚胎期生长因子，可在胎盘中调控糖原合成及合成细胞的量, 是调节葡萄糖转运的主要因子。IGF-Ⅱ不但可以促进细胞的增殖、分化、成熟，还可抑制细胞的凋亡；它可以介导生长激素的大部分作用，可促进机体的生长和合成代谢，并有调节免疫、降低血糖等作用，它还在肌肉和脂肪组织中具有胰岛素样作用，可通过和胰岛素 A 型受体高亲和性的结合从而发生细胞丝裂效应.IGFs 的生物学功能需要通过特异性的 IGF- 受体介导完成， IGF-ⅠR、IGF-ⅡR 两种受体分别与各自的配体以高亲和力结合， 只存在 10 %的交叉配体.IGF-ⅡR 是一种分布于细胞胞质和高尔基体上的跨膜糖蛋白，它在处于活跃增殖期的胚胎肝脏细胞内呈现高表达状态。自分泌生长刺激机制是肝癌细胞恶性增殖的重要原因，而 IGF-Ⅱ与IGF-ⅡR 的过量表达可能是其中一个分子基础.在本实验中叶酸缺乏组 13.5 dpc 胎鼠肝脏中 IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR 的表达量均低于正常对照组，说明两者可能存在协同作用。Calvo MT 等研究证实，IUGR 胎儿 IGF 基因表达明显受抑制。多项国内研究，通过对比分析 IUGR 孕妇和正常孕妇在孕中期及分娩时羊水、母血、脐血中 IGF 系统的表达，发现无论在孕中期还是分娩时，IUGR 组脐血或羊水中 IGF-Ⅱ水平都较对照组显着降低.

　　动物研究发现，IGF-Ⅱ基因敲除鼠显示出明显的 IUGR 及胎盘缩小， 虽生后可显示近似正常的生长速率， 但实际体重、身长仍低于正常对照鼠，同时敲除 IGF-Ⅰ及 IGF-Ⅱ基因鼠显示严重 I-UGR, 所有鼠生后均死于呼吸衰竭.另外，Lassarre 等发现，IGF-Ⅱ基因过度表达， 胎儿体重及生长发育速度明显增加。以上实验结果证实了 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 在胎儿生长发育中的重要作用，与 IUGR 密切相关。

　　3.3 叶酸缺乏与 IGF
    Santoso MI研究过叶酸缺乏与 TGF-β1 和 IGF-Ⅰ表达量之间的关系，发现叶酸缺乏组母鼠血清和胎鼠颅骨中 TGF-β1和 IGF-Ⅰ的表达量都比对照组低；近期 Kim HW的研究表明父体叶酸缺乏会导致子代胎鼠脑部整体甲基化降低，并使 IGF-Ⅱ蛋白表达量下降。研究提示叶酸缺乏会影响 IGF 系统中相关基因的表达，而在本实验建立的叶酸缺乏小鼠模型中，胎鼠肝脏组织 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表达量也发生了类似下降。由于叶酸为蛋氨酸合成所必需，而蛋氨酸的代谢中间物 S- 腺苷蛋氨酸在甲基转移酶的作用下转变为 S- 腺苷同性半胱氨酸的过程为体内广泛存在的甲基化反应提供甲基，而 DNA 的甲基化是调控基因表达的重要形式。有研究表明，IGF-Ⅱ基因的差异性甲基化区（DMR） 去甲基化状态使其能与增强子阻遏蛋白（CTCF） 结合，CTCF 能阻断增强子对 IGF-Ⅱ基因启动子的作用，使 IGF-Ⅱ不能有效地转录，进而降低 IGF-Ⅱ基因的表达.在本实验中，IGF-Ⅱ表达水平的降低，可能是由于母鼠的叶酸缺乏状态影响 IGF-Ⅱ基因 DMR 区的甲基化程度引起的。由于体内循环中 IGF 因子减少，可能无法满足细胞生长的正常生理需要，进而影响胚胎的生长发育。

　　综上所述，本文通过建立围孕期叶酸缺乏的小鼠模型，研究了母鼠叶酸缺乏对胎鼠发育和肝脏 IGF 系统基因表达的影响，结果表明叶酸缺乏会引起孕中期小鼠 IUGR 率增高且降低13.5 dpc 胎鼠肝脏内 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表达水平。研究结果提示，叶酸缺乏对 IGF 系统基因的调控，可能参与到胎鼠 IUGR率增高的机制之中。胎儿的生长是多因素共同作用的，本文对与胚胎发育关系较密切的部分 IGF 基因进行了测定， 除 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表达量发生变化外，其他基因未发生变化。在后续研究中，将扩大样本量，检测组织叶酸浓度，并对 IGF 基因的甲基化程度进行测定，进一步探讨叶酸缺乏改变 IGF 基因表达、影响胚胎发育的机制。
　　
　　参考文献（References）
　　[1] Lindblad B, S Zaman, A Malik, et al. Folate, vitamin B12, and homoc-ysteine levels in South Asian women with growth-retarded fetuses [J].Acta Obstet Gynecol Scand, 2005, 84（11）： 1055-1061
　　[2] Xiao S, DK Hansen, ET Horsley, et al. Maternal folate deficiency res-ults in selective upregulation of folate receptors and heterogeneous nu-clear ribonucleoprotein-E1 associated with multiple subtle aberrationsin fetal tissues [J]. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2005, 73（1）：6-28
　　[3] 杨慧敏， 孙轶， 周天鸿， 等。 叶酸缺乏孕鼠子代脑组织 DNA 甲基化变化 [J]. 营养学报， 2004, 26（3）： 187-191Yang Hui-min, Sun Yi, Zhou Tian-hong, et al. Effects of maternal fol-ate deficiency on DNA methylation [J]. Acta Nutrimenta Sinica, 2004,26（3）： 187-191