发育毒性研究中动物胚胎肢芽培养技术的运用

　　随着现代科学技术和工业生产的迅速发展以及生活水平的提高，人类所面临的各种有害化学物质与新合成的化学物质、居室内外的空气污染物及一些生物、物理因素等对人体有害的因子越来越多。因此检测相关因子对生物个体潜在的遗传毒性及胚胎发育毒性的技术和方法也日益丰富。由于医学实验动物的胚胎发育时期比成年动物对环境中有害因素的影响更敏感，故常以检测胚胎发育毒性作为评价和筛检外源性化学、生物等因素的主要方法之一，同时也可探讨其致畸作用机理、染毒剂量、时间及胚龄与致畸效应之间的量效关系和时效关系等，为各类物质的发育毒性提供安全性评价依据。

　　动物胚胎的器官形成期是由胚胎细胞快速分裂、增殖、分化、运动、聚合并形成组织器官原形的过程，如果进行体外器官培养则能避免母体内多种因素的干扰，且能保持其体内所具有的细胞间相互作用及形态特征和功能，它所经历的器官发生阶段与体内表现有一致性，所以生殖毒理及胚胎发育毒理的研究大多采用大鼠与小鼠鼠胚、鸡胚、兔胚、斑马鱼胚等多种实验动物胚胎材料进行体外全胚胎培养技术、或体外胚胎器官培养技术（如胚胎肢芽、上颌发育等）以及胚胎原代细胞培养技术（如肢芽细胞、中脑细胞、海马细胞、心肌细胞、成纤维细胞）等，但是目前最常用仍为大鼠与小鼠的胚胎肢芽培养模型[1],因为此试验方法中所选择的胚胎肢芽细胞正处于分化前期，所以只要对动物胚胎增殖分化有毒性作用的外来化合物，都有可能抑制胚胎肢芽的形成及软骨的发生。因此，肢芽器官及肢芽细胞培养技术，既可以作为化学致畸物的安全评价系统，又可应用于胚胎发育毒性机理的研究。本文就近 15 年来我国肢芽器官与肢芽细胞体外培养技术的应用及进展作一综述。

　　1 动物胚胎肢芽体外培养常用的技术

　　目前动物肢芽体外培养实验方法大多选择以小鼠、大鼠胚胎的肢芽为体外培养材料，常采用两种的技术方法 :

　　第一，以肢芽整体器官在体外培养为主的试验方法，称肢芽器官培养法。是指应用显微解剖技术从动物体内分离出整体肢芽器官，在体外实验室里尽可能模拟体内的生存条件进行培养，使其生存、继续生长、正常发育，并保持其有正常的结构与功能，以便在可控条件下进行形态学、组织学等多方面的实验研究。如对培养后的大鼠或小鼠肢芽进行阿利新蓝染色，可观察其软骨的发育并对其发育状态给予评价（如 Neubert 评分）[2],或肢芽整体包埋切片后观察肢芽软骨发育的形态学变化，或应用免疫组化、原位杂交等方法检测各种与发育相关基因、蛋白的表达，以分析其影响发育的机制。此方法的特点是能体现肢芽的整体发育状况，并可与体内相当发育时期的肢芽作对比分析，以探讨体外培养时检测某单一因素对胚胎的发育毒性。第二，以胚胎肢芽制备原代肢芽细胞悬液在体外培养为主方法，称肢芽细胞培养法。此方法可使肢芽中未分化的间充质细胞经体外培养后，对细胞增殖的影响进行检测，或者肢芽细胞经培养后能够相互的识别、移动、粘附着后聚集在一起，对形成分化后的软骨细胞集落进行观察。此项技术最早由 Flint 等在 80 年代建立的，后来 Renault 等又加以改进成微团培养法，一般采用正在分化的啮齿类及鸟类的胚胎原代肢芽细胞体外培养模型，模拟体内发育过程，研究细胞间通讯、细胞和胞外基质的相互作用，用于分析各种暴露因子的生殖与发育毒性[3,4],在我国开展此项技术始自上世纪 80 年代初期，至 90 年代中期开始广泛用于发育毒性物质的检测中。并发现一些化学致畸物大多也都是细胞分化抑制剂，能使微团培养物中的细胞集落形成数明显减少，通过细胞集落数的变化研究化学物对肢芽软骨发生的作用，判断其发育毒性。

　　2 肢芽培养技术在发育毒理学中的研究与应用

　　2.1 有毒化学物质及环境污染物对肢芽细胞增殖分化的影响

　　近年来人们针对室内的环境污染日益担忧，如甲醛、二甲苯、氟等多种有毒物质的污染对于人类发育中的婴儿、幼儿及胚胎均有着不同程度的遗传毒性及胚胎发育毒性。

　　有学者选用小鼠肢芽体外培养方法分别研究了甲醛、苯、氟化物及乙醛的发育毒性，结果发现均可抑制小鼠胚胎肢芽的发育和分化，证实是潜在的致畸物。如吴成秋、李梓民等发现随着培养液中苯的染毒浓度的增加，培养的小鼠胚胎肢芽软骨细胞的集落数会逐渐减少，肢芽细胞增殖受到抑制，两者均呈现较强的剂量 - 效应关系[5-8].张全新、屈卫东等则均选用了大鼠胚胎肢芽细胞体外培养，也证实甲醛、甲苯、二甲苯这三种污染室内生活空气的主要物质具有上述研究的类似作用，且联合染毒后毒性有相加作用[9];屈卫东也证实了乙醛具有发育毒性作用和潜在的致畸作用[10].

　　丙烯睛（ACN）、双酚 A（BPA）、等均为重要的有机化工原料，且有着不同程度的毒性，在其工业生产、加工运输、储藏销售等多种环节均与人类有着密切的接触。对这些化学有机物质的各类毒性研究范围也在不断拓展。如端礼荣等用大鼠胚胎肢芽细胞培养技术研究发现丙烯睛能抑制胚胎肢芽细胞增殖和分化，并经其它检测指标分析，丙烯晴抑制了肢芽细胞蛋白质合成、引起脂质过氧化而产生了细胞毒性[11].曾怀才等用小鼠胚胎肢芽细胞通过彗星实验检测了环境污染物氯化三丁基锡（TBTCI）证实其具有遗传毒性[12].李勇、龙鼎新等采用大鼠肢芽细胞微团培养技术检测了工业污染物双酚 A、对 - 壬基酚，证实均具有抑制肢芽细胞增殖作用，属于阳性致畸物[13,14].

　　2.2 微量元素对肢芽细胞增殖分化的影响

　　通过肢芽培养技术可以检测微量元素对肢芽细胞增殖与分化的影响。如硒、锌等微量元素均是机体必需的，但研究证实机体内微量元素含量过多或过少均会影响胚胎发育，并表现出不同程度的胚胎发育毒性。如国内张全新等采用大鼠胚胎肢芽细胞培养技术研究发现 :亚硒酸钠在较低的适当剂量有明显的保护作用，包括抑制畸胎发生。过量就会产生明显的细胞毒性和细胞分化抑制作用，但由于实验结果为 IP50 小于 ID50,所以分析过量导致的肢芽细胞分化抑制是一种细胞毒性物质，具有胚胎发育毒性，而不是致畸物，为硒的安全使用和揭示硒的发育毒性提供依据[15].李小玲等通过给小鼠胚胎肢芽细胞体外培养液中加入不同剂量的硫酸锌，的发现微量元素锌对小鼠胚胎肢芽细胞的分化和增殖表现为促进和抑制双重作用，缺锌及过量锌均可抑制细胞的分化并产生毒性作用[16].郭卫珍也通过小鼠肢芽细胞培养证实当锌浓度达43.0~86.0μmol/L时，对胚胎肢芽发育具有明显的促进作用，而锌缺乏（0.0μmol/L）时或锌过量（172.0 ~ 215μmol/L）以上时均也可抑制小鼠胚胎肢芽的发育和分化[17].许逊等选则大鼠胚胎肢芽细胞培养，加入不同浓度的醋酸锌，得出研究结果与上述类似，即对胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响具有低浓度促进，高浓度抑制的双向效应[18].洪梅等通过大鼠胚胎细胞培养实验证实 :当钙和锌浓度达 50.0 ~ 100.0mol/L 时，对体外培养胚胎肢芽细胞有一定的促进生长分化作用，而钙和锌浓度达 200.0mol/L 时则对胚胎肢芽细胞的生长发育有明显的细胞毒性和抑制作用[19].