miRNA对植物开花时间及花器官发育的作用

　　花是植物最重要的经济器官，花期、花型及花序的分枝等重要性状都是花发育的外在表现.花发育的研究也是分子生物学和发育生物学研究中最活跃的领域。植物生理学的研究表明，成年植物经过一定的营养生长阶段，便由营养型分生组织进入感受态.此时如遇适宜的外界因子，如光周期、光质、低温春化等，营养型分生组织即转化为花序型分生组织，即成花诱导.植物花的发育受环境因子的影响，但从本源来说是环境因子影响这基因调控。随着生物技术不断发展的今天，科学家们开始从表型背后去挖掘潜在的功能基因，并对一大批植物进行分子层面的研究.目前，拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（O ryza sativaL.）、杨树（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、番木瓜（Carica papaya）、苹果（Malus ×domestica）等基因组测序完成，为后续的分子研究奠定了基石.

　　miRNA 最早在线虫（Caenorhabditis elegans）中的Lin-4 和 Let-7 中发现（Lee et al., 1993; Reinhart et al.,2002），随后在人、鼠、线虫中发现了近百种 miRNA（Lau et al., 2001; Lagos-Quintana et al., 2001），并于2002 年首次在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现（Reinhart et al., 2002）。模式植物拟南芥上miRNAs 的发现，开启了植物 miRNAs 研究的新纪元.植物 miRNAs 基于与靶基因的完全匹配或近似完全匹配以切割靶基因的方式在转录后水平调控靶基因的表达（Reinhart et al., 2002）。虽然植物中 miR-NA 的发现较动物中 miRNA 的发现晚 10 年，但随着鉴定方法的不断发展，关于 miRNA 的报道越来越多，miRNA 的作用也越来越受到重视。植物体中miRNA 可参与植物整个生命进程，包括生长发育、器官形成、新陈代谢、细胞增殖和凋亡、逆境胁迫、信号转导以及自身的反馈调节等复杂的生理过程.

　　在秀丽线虫中，miRNA 首次被确认有调控其从幼年到成年过渡的功能，随后在植物 miRNA 中这种调控功能也被证实（Reinhart et al., 2000; Lin et al., 2003）。随着研究不断的深入，发现 miRNA 在植物开花时间的调控及花器官发育上起着不可替代的作用.

　　1 miRNA与植物花期

　　植物花期由内因与外因所形成的复杂调控网络控制，内因与外因的交叉结合，控制了顶端分生组织中成花基因的表达（Srikanth and Schmid, 2011; Yam-aguchi and Abe, 2012）。CO （CONSTANS）是最早分离克隆的开花调节基因之一，CO 表达与花期直接相关.GI （GIGANTEA）是生物钟和光周期的组成因子，连同 FKF1 （FLAVIN BINDING, KELCH REPEATF-BOX 1）去调控 CO 基因的表达（Sawa et al., 2007;Jackson,2009）。CO基因反过来激活花分生组织识别基因，这些基因包括 LFY （LEAFY）、AP1 （APETALA 1）、FUL （FRUITFUL）等基因（Zhou et al., 2013）。同时，在光周期诱导条件下，CO 基因调控 FT （FLOWERINGLOCUSTFT）基因的表达，FT 基因作为信号因子到达茎顶端分生组织处，并与开花位点的转录因子作用去激活其他的开花因子（Amasino, 2010; Matsoukas etal., 2012）。当这些基因的表达达到一定的阈值，花器官基因开始表达，花器官形成（Huijser and Schmid,2011）。在这样复杂的基因调控网中，miRNA 家族起着重要的调节作用.

　　研究发现，在众多 miRNA 家族中，miR156 与miR172 对花期的调控起着重要的作用，二者调控作用相反，保守性强，不仅在模式植物拟南芥中有发现，在山核桃（Carya Cathayensis）、梅花（Prunusmume）、臭橘（Trifoliate Orange）等木本植物中也有发现（Wang et al., 2012; 2013; Zhang et al., 2012）。在模式植物拟南芥中，过表达 miR156 和 miR172 发现，前者推迟花期，而后者则提前花期（Aukerman andSakai, 2003; Wu and Poethig, 2006）。在拟南芥和臭橘的研究中发现，miR156 表达量从幼年到成年阶段不断减少，而 miR172 表达增加（Wu et al., 2009; Zhanget al., 2012; Zhu and Helliwell, 2012）。这种表达模式控制着植物幼年到成年营养生长以及后续的生殖生长阶段（Huijser and Schmid, 2011; Yamaguchi andAbe, 2012）。

　　SPL （SQUAMOSA Promoter-binding protein-like）是在植物的生长发育过程中发挥重要调节作用的一类植物特有的转录因子，它参与植物生理生化过程（Gou et al., 2011）。研究发现，SPL 在拟南芥生殖生长阶段的茎尖和花序中大量表达，表明 SPL 可能在植物的成花诱导中发挥重要调节作用（Zimmermannet al., 2004; Shikata et al., 2009）。拟南芥中 miR156 能抑制 SPL3 的表达，导致早花型（Guo et al., 2008; Wuet al., 2009; Huijser and Schmid, 2011），SPL 单缺陷材料无明显表型，表明 SPL 蛋白存在功能冗余（Yam-aguchiandAbe,2012）。例如，拟南芥中 SPL9 和 SPL15与开花调控有关，二者功能丢失的突变体表型与过表达 miR156 突变体相似（Guo et al., 2008）；相反，过量表达 SPL9 或 SPL15 的转基因株系较早开花，叶片呈现老化（Wuetal.,2009;HuijserandSchmid,2011）。在拟南芥中发现，miR156-SPL3 位点受环境温度调节来影响开花，进而诱导 FT 基因表达（Kim et al., 2012），环境温度影响 miR156 表达，在较低（16℃ VS 23℃）的外界环境温度下 miRNA 被发现有较高的表达水平（Lee et al., 2010; Zhu and Helliwell, 2010）；同时还发现，植物的营养状况与 miR156 表达水平有关，营养物质充当了信号作用（Wahletal.,2013;Yangetal.,2013）。

　　植株从幼年到成年阶段，随着光合能力的增加，糖类物质也在增加，而糖类物质的积累使得 miR156 的表达减少，糖类物质的减少则导致 miR156 表达增加，继而导致 SPL 表达减少（Yangetal.,2013）。

　　miR172 是另一个目前研究较深入的调控花期的 miRNA.研究发现 miR172 是 miR156 下游基因，在花期调控上的作用与 miR156 相反，miRNA172 抑制 AP2 基因表达，从而减轻对花的抑制（Zhu and Helliwell,2010）。拟南芥中，AP2包含6个基因分别是AP2、TOE1 （TARGET OF EAT 1）、TOE2、TOE3、SHLAF-MUTZE （SMZ）和 SCHNARCHZAPFEN （SNZ） （Auk-erman and Sakai, 2003; Yamaguchi and Abe, 2012），拟南芥中 AP2 型蛋白在种子时含量最高，随着植株的生长，miR172 增加 AP2 型蛋白减少，花的抑制也因此得到减轻（Zhu and Helliwell, 2010）。拟南芥中过表达 miR172,无论在长日照还是在短日照均产生了早花表型（Aukerman and Sakai, 2003; Zhu and Helliwell,2010）；miR172 过表达正调节 FT 基因和花分生组织基因 LFY 和 AP1 （Zhu and Helliwell, 2010）；过表达AP2 型基因如 SMZ 和 SNZ,导致晚花表型（Yam-aguchi and Abe, 2012）；miR172 不仅受 SPL 基因调节，同时也受到光周期和外界温度影响 （Ao et al.,2012; Yamaguchi and Abe, 2012）。

　　miR159、miR319 与花期的调控有一定的关系，但对其调控花期的研究不像 miR156 和 miR172 那样清晰（Amasino,2010）。在文冠果（Xanthoceras sorbifolia）、苹果（Malus domestica）、金丝桃（H. monogynumL.）等木本植物研究中对 miR159 与 miR319 均有发现（Aoet al., 2012; Xia et al., 2012; Galla et al., 2013），说明二者相对较为保守.miR159 和 miR319 相关的靶基因分别为 MYB 和 TCP 转录因子。miR159-MYB 在 GA途径上起到调节作用，研究发现，在拟南芥中，非诱导条件下可促进开花（Terzi and Simpson 2008; Yam-aguchi and Abe, 2012）；利用 GA 处理，DELLA 降解导致 miR159 增加（Jin et al., 2013）；miR159 在 GA 诱导 MYB33、MYB65 和 MYB101 途径中，起到了调节作用，过表达 miR159a 延迟开花，MYB33 和 LFY 转录水平也随之降低.拟南芥中 miR319 的靶基因分别是 TCP2、TCP3、TCP4、TCP10 和 TCP24 （Rubio-SomozaandWeigel,2011;Endoetal.,2013）。miR319-TCP交互作用与其他的 miRNA 作用方式存在差别，二者碱基配对出现 6 个错配（Schommer et al., 2012），而在大多数植物中 miRNA 与靶 mRNA 错配不超过 4 个。

　　在拟南芥研究中，长日照条件下，过表达 miR319 延迟开花（Jones-Rhoades et al., 2006; Terzi and Simpson,2008），其靶基因 TCP4 功能的丢失与其出现了相同的表型（SarvepalliandNath,2011;Schommeretal.,2012）。

　　miR159 与 miR319 在碱基序列上存在很大的相似性，但这两个 miRNA 不能交叉调节 TCP 和 MYB,表明miR159 和 miR319 在植物发育中起着重要调节作用（Jones-Rhoadesetal.,2006;Palatniketal.,2007）。

　　miR390 和 miR399 对花期上的调控作用没有那么直接.拟南芥中 miR390 通过间接抑制 ARF3（Auxin Response Factor 3）和 ARF4 转录因子（Endo etal., 2013; Rubio-Somoza and Weigel, 2011）。ARF3 和ARF4 对幼年期到成年营养阶段的转变有促进作用，miR390 通过延长幼年阶段来延迟开花（Rubio-So-moza and Weigel, 2011），ARF3/4 的增加诱导 SPL3/4表达，加速幼年到成年营养生长阶段（Rubio-Somozaand Weigel, 2011）；环境温度可以调节 miR399,miR399 调控模型为 miR399-PH02-IPS1,过表达miR399 或 PH02 功能丢失，长日照条件下生长在正常的环境温度（23℃）下较早开花，而在低温下花期没有变化，表明 miR399 调控与环境温度有关（Kim etal., 2011）。

　　2 miRNA与植物的花器官

　　植物完全花自外向内由 4 轮器官组成，分别为花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊.Coen 和 Meyerowitz （1991）在研究拟南芥和金鱼草（Antirrhinum majus）时提出了花发育的 ABC 模型，认为决定花器官发育的基因分为 A、B、C 三类，三类基因互相协作共同调控花器官的发育.

　　通过对拟南芥研究发现，miRNA 对植物的花型起到重要的调节作用.miR164 家族（miR164a,miR164b, miR164c） 靶基因为 NAC （CUP-SHAPEDCOTYLE-DON1 （CUC1）与 CUC2）转录因子。miR-NA164 家族被预测负调控 CUC1、CUC2 和 NAC 家族的另外 4 个基因（Erik et al., 1996），调控植物花瓣，雌、雄蕊间的转化。CUC1 和 CUC2 是两个器官原基形成所必须的基因，与器官形成的调节有关，在CUC1 和 CUC2 双突变体中，出现了器官融合、雌蕊和雄蕊的减少或丢失的表型（Mitsuhiro et al., 1997）。

　　在文冠果的研究中发现，miR164 使分生组织保持和花器官分离（Ao et al., 2012），在梅花、文冠果中miR164 起到负调节作用，在花芽发育阶段与雄蕊的发育有关（Ao et al., 2012; Wang et al., 2013）。在拟南芥的突变体 eep1 中，主要表型是早花中花瓣数目增加（Baker et al., 2005），靶基因 CUC1 和 CUC2 转录本表达增加（Baker et al., 2005），在转基因株系中从它的内源启动子中表达 CUC1 的 miR164 抑制因子结构，导致了花瓣数目的减少（Baker et al., 2005）。在文冠果的野生型与突变体研究发现，miR164 在野生型积累量较同一时期的突变体高（Ao et al., 2012），由此可知，eep1 重瓣型产生的分子基础是 CUC1 和 CUC2mRNA 的增加（Baker et al., 2005）。在花芽中 miR164c表达分析表明，miR164c 表达强烈，CUC1/2 转录子也有积累，表明通过完全消除 CUC1/2 mRNA,miR164c 也许不能调节花瓣数目（Baker et al., 2005），所以调节好 miR164 与其靶基因间的关系是使植物花型完整的关键。miR163 家族与 SUPERMAN 转录因子有关，此基因在拟南芥中控制花器官的形态建成，尤其是调控雄蕊和心皮边界的发育，这个基因在花发育的早期表达，同时此基因与花发育的 ABC 模型中的其它基因互作.金丝桃中 miR414 在花发育过程中存在大量转录本，预测其对花发育的调控有重要作用（Galla et al., 2013）。miR172 与 miR156 对花期的调控作用非常明显，二者对花型的调控也有一定的作用。miR172 在花发育的早期起到关键作用，miRNA172 抑制 AP2 表达，使花瓣数目减少。猕猴桃（A. chinensisPlanch）研究中，AP2 基因在花瓣组织中高度表达，在突变体多重花被中积累量增加，表明 AP2 参与花被的调控（Varkonyi-Gasic et al., 2012）。在野生型猕猴桃花中，上表皮、雄蕊的维管结构、心皮的维管薄壁组织中均发现 miR172,所以猕猴桃花被中 miR172 的积累可能是由维管组织中 miR172 运动引起的（Varkonyi-Ga-sic et al., 2012）。在猕猴桃突变体花中 miR172 减少，可能是花器官中局部下调的结果，也可能是 miR172分布的调节错误造成的，同时也不排除维管组织发育被扰乱引起的（Varkonyi-Gasic et al., 2012），而后者可能是其根本的影响因素.

　　拟南芥中过量表达miR172 可使花瓣数目减少，萼片转为心皮，用强启动子过表达抗 miR172 的靶基因 AP2,导致花器官的同源转换（Chen, 2004）；过量表达 miR172 能够引起AP2 蛋白水平的降低，同时也会产生异常花的表型（Aukerman and Sakai, 2003; Chen, 2004）。拟南芥中SPL 表达量减少，顶端优势降低，花序长变短，增加花序分支增多，花序的形态建成也因此受到干扰（Schwab et al., 2005; Shikata et al., 2009），SPL 基因对花青素合成代谢过程中起负调控作用，增加 miR156活性会促进拟南芥花青素的积累（Gou et al., 2011）。

　　在拟南芥研究中发现 miR166/165 靶基因有 5个，分别为 REVOLUTA（REV）、PHABVLOSA（PHB）、PHAVO-LVTA （PHV）、CORONA （CNA）/ATHB15 和ATHB8,miRNA 通过降解靶基因起到调控作用（Williams et al., 2005; Byrne, 2006）。在山核桃研究中发现 miR166 表达最丰富，且很保守（Wangetal.,2012）。

　　拟南芥中 miR165 家族有 2 个成员，miR166 家族有7 个成员，成熟的 miR165 与 miR166 序列仅有 1 个核苷酸的差别（Reinhart et al., 2002），尽管仅有 1 个核苷酸的差别，但二者均对所有的 5 个靶基因起作用（Tangetal.,2003）。如在拟南芥突变体 men1 和 jba-1D中 miR166a 和 miR166g 被激活，靶基因 PHB、PHV和 ATHB15/CNA 转录水平显着减少，REV 和 ATHB8变化不明显（Kimetal.,2005）；在 men1 和 jba-1D 突变体中，出现了一系列不同的表型变化，包括花分生组织、花结构、雌蕊发育及叶子形态（Kim et al., 2005），miR166a/miR166d 主要在雌蕊中表达，miR166b 在胚珠和柱头上表达，miR166d 在胚珠中高表达，而miR166g 表达范围较广泛，它在柱头、雄蕊和花托上均有表达，但在胚珠上没有表达，miR166/165 在萼片和花瓣中表达水平相当低，所以说 miR166/165 基因在不同植物组织中存在着空间和时间上的表达形式。在文冠果的突变体中 miR166g 显着上调，miR166g 在突变的文冠果中表达量高于野生型（Ao etal., 2012），表明 miR166 调控雌蕊和心皮发育。在拟南芥 men1 和 jba-1D 突变体中 miR166/165 超表达，使得 SAM（shootapicalmeristem）活动加速，从而花的结构被破坏；干细胞基因如 WUS（WUSCHEL）和 CLV3（CLAVATA3），在 miR166 高表达的突变体中表达量显着变化（Kimetal.,2005），WUS 显着上调，CLV3 确略有下降（Kim et al., 2005），表明 miR166/165 也许通过WUS-CLV路径行使功能。

　　miR319 家族由 miR319a、miR319b 和 miR319c组成，三者在植株幼苗和花序中均有表达，但是在雄蕊和花瓣中只能检测到 miR319a 明显的持续表达（Nag et al., 2009）。在拟南芥 miR319a 突变体中观察发现，花瓣狭窄，矮短以及雄蕊存在严重生殖缺陷（Nag et al., 2009）。在文冠果中发现 miR319 与花器官的大小和形状有关，突变体中 miR319 的表达量高于野生型（Ao et al., 2012）。进一步研究 miR319a 和其 5个靶基因表达发现，TCP4 是 miR319a 主要的靶基因且对其调控在花发育过中尤其是花瓣和雄蕊起着至关重要的作用.