人牙周膜成纤维细胞对盐酸林可霉素跨膜转运的色谱情况

　　牙周炎、冠周炎等牙科疾病严重危害人类健康,也给患者带来极大痛苦[1].该类疾病的发作与厌氧菌感染相关,抗生素的应用十分普遍.林可霉素属于对多数厌氧菌、需氧菌有较强抗菌作用的广谱抗菌药,通过阻断敏感菌核糖体的脓链延长来达到掏细菌细胞蛋白合成的作用.林可霉素早期被应用于骨髓炎、骨和关节感染、败血症等的临床治疗中,并取得一定疗效[2],其应用于牙周疾病的治疗方面效果如何,目前报道尚少.本研究探讨了人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)对盐酸林可霉素跨膜转运的色谱情况,旨在为牙周局部和全身给药提供实验数据.

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与设备

　　高糖DMEM培养基和胎牛血清由美国GIBCO公司提供,胰蛋白酶由美国Amresco公司提供,杭州四季青新生牛血清由浙江天杭生物科技有限公司提供,盐酸林可霉素由美国Fluka公司提供.细胞培养皿由美国Coring公司提供,Agilent 1100 LC高效液相色谱仪由美国Technologies公司提供,图像分析系统由德国莱卡公司提供,JY98超声细胞粉碎机由宁波新芝生物科技股份有限公司提供.高效液相色谱法(HPLC)应用试剂为色谱纯,其它细胞培养试剂为分析纯.

　　1.2 HPDLF细胞培养

　　在患者同意的情况下,取我院11~24岁年龄段行正畸治疗时需拔除的健康前磨牙,以无菌生理盐水和培养基冲洗,取牙根中部1/3处进行牙周膜组织刮取,剪成碎屑并置入高糖CMEM培养基(含15%胎牛血清)贴壁培养,培养条件:饱和湿度、5%二氧化碳、37℃,3h后翻瓶.

　　传代HPDLF细胞大量繁殖后,取6~10代用于本组实验.MC3T3-E1细胞常规培养,饱和湿度、5%二氧化碳、37℃培养条件下于高糖DMEM培养基(含10%新生牛血清)培养[3~4].

　　1.3 样品制备

　　传代HPDLF细胞1 mL接种于12孔板,密度5×104/m L , 常规条件下培养至细胞融合 , 行分组实验.室温(25±2℃)下以浓度0.01 mol/L PBS行细胞快速冲洗,培养皿中加入盐酸林可霉素药液孵育,常规洗涤收集.超声细胞粉碎机于冰浴条件下行细胞粉碎,超声功率400W,循环操作30次,每次运行3s,各次间隔4s.裂解液高速离心后取上清液,应用孔径0.22 μm的滤膜过滤处理,高效液相色谱仪下行色谱检测[5].

　　1.4 色谱条件

　　实验温度(25±2)℃,实验湿度(60±20)%.流动相应用孔径0.45 μm滤膜于真空负压条件下过滤后,超声排气.紫外检测器,流速1ml/min,分析柱250mm×4.6mm5μm,柱温30℃,进样10μL,波长214nm[6].

　　1.5 盐酸林可霉素流动相

　　浓度0.05mol/L PH值6.0的硼砂溶液、甲醇和乙腈混合液,配比比例分为5种:(1)75:20:5,(2)70:10:20,(3)60:20:20,(4)70:15:15,(5)70:17.5:12.5.对各配比的峰形、保留时间等参数进行比较分析,最终选取配比为70:17.5:12.5的混合液进行相关研究.

　　1.6 蛋白浓度检测

　　细胞裂解液加入考马斯亮蓝染液充分混匀,于室温下静置10min,595nm紫外分光光度计测定吸光度,参照标准品浓度获得标准曲线并计算蛋白浓度.各样品均行3次检测后,取平均值作为最终研究比较数值.

　　1.7 统计学处理

　　盐酸林可霉素浓度与峰面积相关性应用线性回归分析.PBS为空白对照组,不加药细胞组样本为阴性对照组,标准品为阳性对照组.各组样本量超出3个.

　　2 结果

　　2.1 色谱学指标

　　2.1.1 峰值 盐酸林可霉素主成分峰保留时间为8.425min,主成分峰未受到进样峰影响,表示分离度良好.空白对照组、阴性对照组于盐酸林可霉素保留时间附近无峰值.

　　2.1.2 线性关系 以药物浓度为X轴、以峰面积为Y轴进行直线回归分析,获得回归方程Y=-1.1883+1.3163X,浓度范围2 μg/ml-80μg/ml,如图1所示,药物浓度与峰面积的线性关系良好.

　　

　　2.1.3 回收率 分别对5μg/mL、20μg/mL和80μg/mL浓度的标准品进行检测,每种浓度均备足3份分别检验,并取平均值作为研究结果.如表1所示为盐酸林可霉素回收率情况,平均回收率96.71%,平均相对标准偏差(RSD)2.99%.

　　

　　2.1.4 重复性 对1份样品连续进行5次检测,获得平均相对标准偏差为2.69%.

　　2.1.5 精密度 同日内间隔性进行标准品溶液的多次测定,日内相对标准偏差为2.52%,日间相对标准偏差为3.82%.

　　2.2 胞内药物浓度

　　进行盐酸林可霉素HPDLF细胞和MC3T3-E1细胞培养过程中,对浓度10μg/ml样品分别于1、5、10 min时进行胞内药物浓度检测,结果均未发现细胞内有药物存在;对浓度20μg/ml样品分别于5、10 min时进行胞内药物浓度检测,仍未发现细胞内有药物存在.

　　3 讨论

　　牙周组织细胞在抗菌药给药环境下的跨膜转运情况对于控制炎症具有重要作用,该转运过程有利于对细胞内感染各类细菌的抗菌治疗.刘洪臣提出假说,认为根管以及牙周组织的通路给药,可使药物转运至牙周局部组织乃至全身细胞组织[7].研究和探讨相关抗菌药的跨膜转运情况对牙周局部和全身给药的相关研究具有重要意义.

　　Johnson等的研究认为林可霉素族药物可在肺泡巨噬细胞中实现转运[8],Klempner等研究氯林可霉素在中性粒细胞中可实现转运[9],Hand等报道氯林可霉素可在单核细胞中转运[10].但本组研究结果未发现盐酸林可霉素在HPDLF中存在转运,与相关报道有所差异,可能由于药物结构、检验方法学、细胞类型等有关.药物结构方面,尽管有研究指出林可霉素类抗菌药在某些细胞中存在跨膜转运,但目前鲜见对盐酸林可霉素的具体研究,可能受到盐酸林可霉素与其它林可霉素类用药间的结核性差异影响;方法学方面,虽然波长检测具有较好的抗菌药物含量检测效果,但其贴近于紫外检测器下限,易造成流动相中乙腈等有机物的末端吸收,产生较大噪音,这可能是影响检测灵敏度的因素之一;细胞类型方面,国内有研究检测罗红霉素、甲硝唑、替硝唑的HPDLF跨膜转运情况,但无盐酸林可霉素对HPDLF转运的研究.目前抗菌药在细胞间的转运基质尚不明确,因而暂时无法明确HPDLF中抗菌药无转运的具体原因.

　　当然,刘洪臣的报道仅为假说,也可能确实存在HPDLF和MC3T3-E1细胞无盐酸林可霉素跨膜转运的情况,是否可以通过根管及牙周组织的通路给药使药物转运至牙周局部组织和全身以达到抗菌抗炎作用,仍需进一步研究分析探讨.

　　参考文献

　　1 刘贵臣. 牙周炎患者正畸治疗过程中龈沟液及血清中多项白介素、PGE2、SICAM-1及PAK5水平的变化研究[J]. 中国医药导刊,2012;14(6):989~990

　　2 江漫 , 赵红 . 我院 2 0 0 9 年抗感染药物不良反应报告分析 [ J ] . 中国医药导刊,2010;12(8):1397~1398

　　3 刘宇,刘洪臣,吴霞,等. 人牙周膜成纤维细胞对甲硝唑替硝唑的跨膜转运[J]. 口腔颌面修复学杂志,2007;8(2):90~93,96

　　4 余立强,刘洪臣,吴霞,等. 人牙周膜成纤维细胞对甲硝唑摄取机制的研究[J]. 中华老年口腔医学杂志,2009;7(2):71~75

　　5 刘宇,刘洪臣,吴霞,等. 人牙周膜成纤维细胞对罗红霉素的跨膜转运[J]. 北京口腔医学,2008;16(3):138~141

　　6 邵蓓新,张颖,李建军,等.毛细管电泳-电致化学发光法测定盐酸林可霉素[J]. 郑州大学学报(工学版),2011;32(4):99~102

　　7 刘洪臣. 牙根管全身给药假说[J]. 中华老年口腔医学杂志,2007;5(1):2~3

　　8 高云,钟良军,张源明,等. 慢性牙周炎合并动脉粥样硬化兔动物模型的抗炎干预研究[J]. 中华实用诊断与治疗杂志,2011;25(4):326~330

　　9 梁菁,赵红宇. 牙周炎与冠心病关系的研究进展[J]. 中华口腔医学研究杂志(电子版),2011;5(3):328~332

　　10 吴莹莹,刘洪臣.TNF-α、IL-1β及IL-6与糖尿病及牙周炎之间的关系[J].中华老年口腔医学杂志,2011;9(2):117~121