不同温度、湿度下红缘天牛幼虫对绿僵菌的影响

　　红缘天牛 Asias halodendri （ Pallas） 属鞘翅目Coleoptera 天 牛 科 Cerambycidae 天 牛 亚 科Cerambycinae 亚天牛属 Asias Semenov,是一种危害严重，寄主广泛的蛀干害虫。有文献记载的红缘天牛的寄主有 23 种之多 （ 孙逢海等，1994; 王大洲和王金华，2002; 王直诚，2003; 王建伟等，2007） ,分别为柳、栎、榆、李、桃、梨、枣、沙枣、酸枣、沙棘、油茶、白栎、忍冬、苹果、旱柳、枸杞、糖槭、加杨、葡萄、刺槐、四合木、锦鸡儿和小叶榆等。另外，作者在天津地区的主要绿化树木国槐枝条上发现大量红缘天牛幼虫，对当地的经济树木枣树的危害也相当严重。

　　绿僵菌 Metarhizium anisopliae 是最早用于生物防治的昆虫病原真菌 （ 李春香等，2006） .自从1879 年梅契尼柯夫最先从奥地利金龟上分离到金龟子绿僵菌以来，已有 100 多年的历史。50 - 80年代人们对绿僵菌的研究仅限于形态、分类、培养特性、生理生化、感染机制及其影响因素等方面 （ 郭素萍，2004） ; 随着巴西和澳大利亚广泛使用金龟子绿僵菌防治甘蔗和牧草害虫取得较大进展，以及在非洲用黄绿绿僵菌防治蝗虫的试验初步成功，对绿僵菌的研究进入了新的阶段。用它制成的生物制剂可防治 200 多种害虫 （ 李春香等，2006） ,且效果良好。这项技术显示出良好的发展趋势，是生物技术开发的热点，在世界科技领域受到高度的重视 （ 张一宾和吴霞，1998; 郑爱萍和李平，2000; 罗于洋等，2002） .绿僵菌具有寄主广，致病力强，对人、畜、农作物无毒，不污染环境、菌剂易生产，持效期长等优点，是当今世界上研究和应用最多的虫生真菌之一，具有广阔的应用前景 （ 王海川和尤民生，1999） .

　　本文主要介绍不同温、湿度下绿僵菌对红缘天牛的致病力的影响，旨在寻找出绿僵菌感染红缘天牛的最适温度和最佳湿度，以期为红缘天牛的防治提供依据。

　　1 材料与方法
　　
　　实验用红缘天牛幼虫部分从野外采集，部分从天津市河北区一宫花鸟鱼虫市场购得，用国槐的新鲜枝条进行实验室内人工饲养备用。

　　幼虫的饲养方法： 根据幼虫的大小选择直径大小为 10 mm -18 mm 的新鲜枝条，截成 200 mm长的木段，在木段的一端用电钻打洞，孔的直径以可以塞入幼虫为宜。把幼虫放入钻好洞内，棉花球堵住洞口。置于温度为 （ 28 ± 1） ℃，相对湿度为 （ 60 ±10） % 人工气候箱饲养，7 d 更换一次枝条。

　　供试的绿僵菌来自江西天人生态股份有限公司，规格为： 孢子粉 （ 含孢量为 200 亿/g） .经PDA 培养基分离纯化，测试活性。

　　孢子悬浮液制备： 取一定量的孢子粉，用0. 1% （ 体积分数） 吐温 80 无菌水稀释，磁力搅拌器搅拌均匀。经血球计数板计数后，配成浓度为 1 ×109分生孢子/mL 的孢子悬浮液。

　　红缘天牛幼虫致病力的测定： 在超净台中在每个灭菌后的培养皿中放入一张灭菌滤纸，并在滤纸上滴入适量甘油，选择生长健壮的幼虫置于培养皿中，每皿 10 头； 将 1 ×109分生孢子/mL 的绿僵菌孢子悬浮液喷洒于幼虫体表，直至孢子液滴下为止； 将处理过的每组红缘天牛幼虫放入相应的培养皿中，每个温度重复 3 次。以 0. 1% （ 体积分数） 吐温 80 无菌水作对照。置于人工气候箱中。人工气候箱的温度和相对湿度自动设定为：

　　相对湿度为 （ 60 ± 10） %,温度分别设为 22℃，25℃ ,28℃ ,31℃ 和 34℃ ; 温度为 （ 28 ± 1 ） ℃ ,相对湿度分别设为 （ 50 - 60） %, （ 60 - 70） %,（ 70 -80） %, （ 80 - 90） % 和 （ > 90） %.每天下午 4 点至 6 点观察记录死亡情况 （ 用毛笔轻触虫体，不动即为死亡） ,并在显微镜下检查是否为绿僵菌感染致死，对绿僵菌致死虫体继续进行同等条件的培养，观察菌丝生长及产孢情况，连续观察 5 d.并计算校正死亡率及累计僵虫率 （ 虫尸上长出肉眼可见的孢子） .死亡率和校正死亡率计算公式为：死亡率 （ %） =死亡虫数/处理实虫数× 100实验数据用 Excel 和 SPSS17. 0 进行统计学分析，再用 SPSS17. 0 中的 Duncan 多重比较法测定不同处理间的差异显着性。

　　2 结果与分析
　　
　　2. 1 不同温湿度下绿僵菌对红缘天牛幼虫的致死率根据每天观察到的不同温、湿度下幼虫死亡状况获得的校正死亡率如表 1 所示。【表1】

　　由表 1 可知分别在 5 个温度、5 个湿度梯度下，绿僵菌对红缘天牛幼虫均有致病力。在 28℃条件下，5 d 后的幼虫的校正死亡率高达 94. 4%,且与其他各组差异显着。高于或低于 28℃条件时，绿僵菌对红缘天牛幼虫致死率都会减弱。相对湿度越大，绿僵菌对红缘天牛幼虫致病力越强。相对湿度为 > 90% 时的致死效果最好，校正死亡率接近 100%,相对湿度 （ 50 - 60） % 时，幼虫校正死亡率显着降低。2. 2 不同温度下绿僵菌对红缘天牛幼虫的致死率、致死速率和僵虫率的影响在温度范围为 22℃ - 34℃ 之间，绿僵菌对红缘天牛的幼虫均有致病力，但不同温度下死亡率不同。28℃下幼虫的死亡率最高，处理第 5 d 的幼虫的致死率高达 94. 4%.温度高于或低于 28℃时绿僵菌对红缘天牛幼虫的致死率都减弱。例如：

　　22℃ 和 34℃ 条件下，处理 5 d 后的幼虫的校正死亡率分别为 72. 2%和 75%.（ 如图 1） .在不同温度下，用 1 × 109分生孢子/mL 的高浓度绿僵菌孢子悬浮液处理幼虫后，统计致死率与时间对数的关系 （ 表 2） .【表2.图1】

　　在实验所设的 5 个处理温度下，致死速率最快的是 28℃，其致死中时 （ LT50） 明显高于其他各组，约为 8 h; 其次是 25℃，致死中时 （ LT50）约为 33 h; 其余各组之间致死速率差异不明显，致死中时 （ LT50） 约为 50 h 左右 （ 如表 1） .

　　从僵虫率看，在 28℃ 条件下，红缘天牛幼虫僵虫率最高为 33. 33%; 温度为 34℃时，红缘天牛幼虫僵虫率为 6%.在22℃ -28℃的范围内，红缘天牛幼虫的僵虫率随温度的升高而升高； 在 28℃- 34℃ 范围内，随温度的升高，幼虫的僵虫率降低。

　　2. 3 不同湿度下绿僵菌对红缘天牛幼虫的致死率、致死速率和僵虫率的影响
　　
　　根据每天观察到的不同相对湿度下红缘天牛幼虫死亡状况获得的校正死亡率如图 2 所示。【图2】

　　在相对湿度 （ >90） % 的条件下，绿僵菌对红缘天牛幼虫致死率最高，而且显着高于其他各组。

　　处理第 5 d 幼虫几乎全部死亡，平均校正死亡率接近 100%.随着相对湿度的降低绿僵菌对红缘天牛幼虫的致死率也降低。相对湿度 （ 50 -60） % 时的幼虫死亡率最低，仅为 60%.相对湿度从 （ 50 -60） % 增加到 （ 80 - 90） % 时第 5 d 的幼虫校正死亡率从 60%增加到 87. 5%.在同一温度不同相对湿度下，用 1 × 109分生孢子/mL 的高浓度绿僵菌孢子悬浮液处理幼虫后，统计致死率与时间对数的关系 （ 表 3） .【表3】

　　从致死时间看，在相对湿度 （ >90） % 条件下的致死速率最快，其致死中时 （ LT50） 约为 35 h;其次为相对湿度为 （ 80 -90） % 的处理，其致死中时 （ LT50） 约为 47 h; 相对湿度为 （ 50 -60） % 的致死速率最慢，其致死中时 （ LT50） 达到 122 h.其余各处理组致死中时 （ LT50） 均超过 50 h （ 如表 3） .

　　从僵虫率看，相对湿度为 （ >90） % 的累计僵虫率最高，达到 50%; 相对湿度为 （ 50 -60） % 的累计僵虫率最低，仅达到 25%.随相对湿度的增加僵虫率也增加。如相对湿度 （ 70 -80） % 和 （ 80- 90 ） % 条件下的累计僵虫率分别是 35. 92%和 40. 48%.
　　
　　3 结论与讨论
　　
　　在不同温湿度条件下绿僵菌对红缘天牛进行感染实验证明，温度是绿僵菌的致病力的影响因素之一。从红缘天牛幼虫的最终死亡率和致死中时 LT50可以看出，28℃ 下最有利于绿僵菌感染红缘天牛幼虫。这可能是由于该菌在此温度下营养生长最大、产孢量最多、萌发速度快且萌发率高（ 王宝辉等，2009） .超过 28℃，温度越高，致死速率越低，僵虫率也越低。例如： 34℃ 时的僵虫率仅为 6%,远低于其他处理温度。这可能高温条件不利于多数绿僵菌孢子萌发 （ 岳梅等，2010） ,因而很难达到较高的死亡率。

　　实验结果也证明，湿度也在很大程度上影响绿僵菌对红缘天牛幼虫的致病力。从红缘天牛幼虫的最终死亡率和致死中时 （ LT50） 可以看出，在 28℃时，相对湿度 （ >90） %较有利于绿僵菌感染红缘天牛幼虫。这是因为绿僵菌孢子在离体萌发时，都需要在相对湿度达 98% 以后的环境才能萌发 （ Ibrahim et al. ,1999） .从本实验的结果也可以看出，相对湿度太低，即使在温度适宜的情况下，绿僵菌的致病力也很低。这说明环境的相对湿度可以影响绿僵菌的生长，进而影响绿僵菌的毒力。

　　因此，温度为 28℃，相对湿度 （ >90） %是绿僵菌感染红缘天牛幼虫的最佳温度和湿度。由此可见，在田间用绿僵菌防治红缘天牛时应尽量选择相对湿度较高、气温较低的天气条件，如阴天、清晨或傍晚，以便更好地发挥绿僵菌的毒力，达到理想的防治效果。

　　研究中发现，红缘天牛幼虫被绿僵菌感染后，死亡症状不相同。部分尸体表面僵硬，体表长有黄绿色菌丝体； 而有些尸体呈黑色或浅紫色，尸体表面看不到菌丝，解剖时发现体腔液浑浊且呈深棕色或黑色。幼虫死亡症状的不同可能与孢子的侵染程度不同 （ 刘颖和殷从松，2010） 及寄主的免疫反应有关。当异物侵人时，寄主体内的颗粒细胞及浆细胞等几种细胞会识别、附着、吞噬异物，并分泌抗微生物物质，使大量的血细胞对异物进行包被囊化及发生与酚类氧化酶有关的黑化反应等 （ 王海川和尤民生，1999） .与黑化反应有关的黑色素 （ melanin） 具有保护寄主免受酶攻击的作用 （ St Leger et al. ,1988） .当寄主的体壁受伤有体液流出时，伤口会产生黑化作用 （ 蒲蛰龙和李增智，1996） .

　　在利用绿僵菌侵染红缘天牛幼虫过程中发现，多数幼虫体长缩短，横纹加深，身体由饱满变为干瘪，部分幼虫会从排泄孔伸出透明且长短不一消化道，这可能是红缘天牛幼虫对外界不良环境应激反应，其机制等还有待于进一步研究。绿僵菌对红缘天牛幼虫的致病力除了受温度和湿度条件影响以外，还受其它因素，特别是复杂的微生物因子的影响。因此，在进行野外防治前还需要进一步的研究，以达到理想的防治效果。