急性放射性皮炎/溃疡模型大鼠的建立

　　急性放射性皮炎系放射线照射引起的急性皮肤和黏膜的炎症性损害，多见于放射性事故和肿瘤放疗引起的并发症，临床表现为局部皮肤红斑、水肿、出血、糜烂、溃疡、渗出、感染等。急性放射性溃疡则属于重度急性放射性皮炎，其溃疡特点为长期顽固性反复发作、晚期易癌变、伴有剧烈疼痛。近年来，随着肿瘤放疗患者的增多，该类疾病有增高的趋势。严重的急性放射性皮炎/溃疡可能会迫使患者中断放疗，极大地影响患者的生存质量和治疗效果。因此，对急性放射性皮炎/溃疡的病理过程、发病机制及防治措施的研究越来越受到国内外学者的重视，其研究的首要步骤是建立有效可靠的动物模型。本研究采用不同剂量高能 X 线照射诱导建立急性放射性皮炎/溃疡模型大鼠，为今后进一步研究该疾病的反应机制以及客观评价药物的控制和预防作用奠定基础。

　　1、 材料与方法

　　1． 1 实验动物

　　清洁级雌性 Wistar 大鼠，体重(250 ± 10) g，由南方医院动物中心提供(动物许可证号 SCXK粤 2006-0015) 。

　　1． 2 仪器

　　直线加速器 CL2100 C(美国制造) ，石蜡切片机 CUT4062(德国制造) ，H-600 型透射电镜(日本日立公司) 。

　　1． 3 方法

　　1． 3． 1 确立照射剂量 将 48 只清洁级雌性Wistar 大鼠随机分成 8 组，每组 6 只，分别为 0Gy、5 Gy、15 Gy、30 Gy、35 Gy 、38 Gy、43 Gy、50 Gy组。先将大鼠用 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉(0. 3 mL/100 g) ，然后将大鼠趴在木板上，摆成矩形，暴露双后肢，以 6 MeV 直线加速器发射的高能 X 线单次局部照射双后肢，放射源与皮肤间距80 cm，非照射部位以铅板遮盖，照射量率为 200cGy /min，各组照射时间分别为0 min、2 min 30 s、7min 30 s、15 min、17 min 30 s、19 min、21 min 30 s、25 min。观察指标: 每日观察大鼠一般情况、照射区域皮肤变化及存活情况。各组均于 14 d 处死动物，观察大鼠的皮肤病理组织变化。

　　1． 3． 2 制备急性放射性皮炎 /溃疡模型 照射方法: 将46 只清洁级雌性 Wistar 大鼠随机分成模型1 组(20 只) 、模型 2 组(20 只) 和空白对照组(6只) 。其中，空白对照组不做任何处理，普通饲料喂养，模型 1 组采用 38 Gy 照射剂量照射，模型 2组采用 43 Gy 照射剂量，照射及麻醉方法同上。

　　观察指标同上。模型 1 组、模型 2 组分别于照射后第 18、60 d 各取大鼠 10 只，脱颈处死，剖取照射区两块约 0. 5 cm × 0. 5 cm 大小的皮肤组织。其中一块以 10% 的福尔马林固定，行 HE 染色，光镜下观察皮肤病理学改变; 另一块以 4% 的戊二醛前固定4 h，磷酸缓冲液清洗20 min，1%锇酸后固定 2 h，经 50%、70%、90% 的乙醇梯度脱水后，环氧树脂 Epon812 包埋剂浸透过夜，60 ℃聚合48 h，经超薄切片和染色后，置入冰箱真空干燥，透射电镜观察其超微病理学变化，将观察结果与对照组比较。

　　2、 结果

　　2． 1 照射剂量的确立

　　照射 14 d 后，当照射剂量小于 35 Gy 时，大鼠的临床征象及皮肤组织病理学均基本正常; 照射剂量为 35 Gy 时，其皮肤及组织病理表现出轻度的炎症反应; 照射剂量为 38 Gy 时，大鼠的皮肤出现显著充血、水肿性红斑等症状，病理上则表现为中度的炎症改变; 照射剂量为 43 Gy 时，其皮肤出现红斑、溃疡等症状，病理上表现为重度的炎症改变; 照射剂量为 50 Gy 时，大鼠相继死亡。具体见表 1。

　　可见，大鼠接受38、43 Gy 剂量照射后，其皮肤肉眼改变及病理学变化分别与急性放射性皮炎和急性放射性溃疡的临床及病理表现基本相符。故选择38 Gy 和43 Gy 作为下一步研究的照射剂量。

　　2． 2 模型评价

　　2． 2． 1 整体征象观察 38 Gy 组大鼠照射 7 d后，照射区有不同程度的脱毛; 其体重及摄食未见明显变化; 照射(12. 2 ± 0. 7) d 后皮肤出现了显著充血及水肿性红斑，部分伴糜烂、渗液，未作任何处理; 照射 60 d 后，创面未自然愈合。43 Gy 组大鼠照射 7 d 后，照射野脱毛明显，部分大鼠摄食减少，体重减轻; 照射(13. 1 ± 0. 6) d 后，有 17 只(85%) 皮肤发生溃疡，未经任何处理，60 d 后形成慢性溃疡。

　　2． 2． 2 皮肤组织病理学观察 照射 18 d 后，与空白对照组相比，38 Gy 组大鼠表皮结构完整，真皮间质水肿，伴少量淋巴细胞浸润; 43 Gy 组大鼠表皮部分坏死，真皮浅层高度水肿，毛细血管管壁变性坏死，周围大片中性粒细胞和嗜酸性粒细胞及核尘分布。照射 60 d 后，38 Gy 组大鼠表皮增厚，真皮全层胶原纤维明显肿胀，皮下血管充血扩张明显，伴淋巴细胞浸润; 43 Gy 组大鼠创面肉芽组织增生较明显，伴有淋巴细胞、浆细胞浸润。

　　2． 2． 3 皮肤超微病理学观察 照射 18 d 后，与空白对照组相比，38 Gy 组大鼠表皮棘细胞及基底细胞的核异染色质增多，有核固缩现象; 43 Gy组大鼠血管内皮细胞核固缩明显，细胞器明显变性，血管壁变性坏死。

　　3、 讨论

　　目前，国内外急性放射性皮炎/溃疡模型的建立，主要有以下几个特点: ①主要集中于60Coγ 射线、β 射线及电子线方面的研究，对 X 射线研究较少; ②所造模型不符合皮肤科临床实际，没有将急性放射性皮炎与放射性溃疡区分开来; ③造模部位大多选用腹部，易使动物的内脏受到影响，进而影响模型动物的生存率。

　　本研究采用直线加速器发射的高能 X 线来建立动物模型，具有剂量准确、可靠，放射源无污染的优点; 选用大鼠双后肢作为造模部位，可有效地降低放射线对动物内脏的影响，提高模型动物的生存率; 由于轻中度的急性放射性皮炎与急性放射性溃疡在临床表现、病理特征、治疗方法及愈合方式方面均不完全相同，因此分别建立了两种类型的动物模型，更切合临床实际，利于临床研究。

　　一般认为电离辐射的生物学效应主要取决于照射剂量，而其大小主要根据研究目的来选择，既要基本反映疾病的临床特征和病理特征，又要最大程度地提高动物的生存率。在预实验中，课题组对不同照射剂量进行了反复探索，证明照射剂量小于 35 Gy 时，大鼠临床征象与皮肤病理改变极其轻微，不足以反映放射性皮炎的特征; 照射剂量达 50 Gy 时，模型动物出现非常高的死亡率;剂量为 38 Gy 和 43 Gy 时，临床征象及皮肤病理改变分别与急性放射性皮炎/溃疡模型接近，故课题组分别选择 38 Gy 和 43 Gy 作为进一步研究的剂量。

　　照射 38 Gy 时，与空白对照组相比，大鼠皮肤出现了显著充血、水肿性红斑等急性炎症反应; 光镜下显示表皮结构完整，真皮间质水肿，伴少量淋巴细胞浸润; 电镜下显示大鼠表皮棘细胞及基底细胞的核异染色质增多，有核固缩现象。照射43 Gy时，大鼠皮肤见红斑、糜烂及较多溃疡; 光镜下显示大鼠表皮部分坏死，真皮浅层高度水肿，毛细血管管壁变性坏死; 电镜下显示血管内皮细胞核固缩明显，细胞器明显变性，血管壁变性坏死。

　　由上可见，照射 38、43 Gy 后大鼠的一般状况与临床表现分别与急性放射性皮炎、溃疡一致，皮肤组织病理形态学及电镜下超微结构的改变也与该疾病的病理特征基本符合，表明模型建立成功。

　　本研究通过单次照射，选择合适的照射剂量及照射部位建立的大鼠急性放射性皮炎/溃疡模型，在临床表现、组织病理及超微病理结构方面的变化符合现代医学对该病的认识，易于操作，成功率高，或许可为急性放射性皮炎/溃疡的发生机理及治疗方面的研究奠定一定的基础。

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