miRNAs与破骨细胞分化相关的骨代谢疾病

　　miRNAs 是长度约 22 个核苷酸的小型、单链、非编码核糖核酸，是最重要的基因调节因子之一[1].据最新 21. 0 版 miRBase 数据库统计，从第1 个 miRNA lin-4[2]于 1993 年发现至今，已发现的miRNAs 达 28 645 条，几乎分布于所有的真核生物和部分病毒中，其中人类有 4 552 条。虽然编码miRNAs 的基因只占人类基因组数量的 1% ,但可调控超过 1/3 的蛋白编码基因[3].miRNAs 除可通过与靶基因 mRNA 的 3'UTR 或 5'UTR 端的特异序列结合外，也可在蛋白翻译的延伸和终止阶段与多核糖体一起介导 mRNA 翻译的抑制效应[4],实现对靶基因的转录后水平调控。甚至在应激环境下，miRNAs 能提高基因的表达[5].miRNAs 与靶基因组成一个复杂的调控网络，调节细胞增殖、分化与凋亡，参与个体发育、机体代谢等过程，控制细胞及个体的重要生命活动。

　　miRNAs 与破骨细胞分化miRNAs 在骨代谢方面的研究目前主要集中于调控成骨细胞分化，但最新研究表明 miRNAs 还参与调控破骨细胞的分化和活性。破骨细胞是由造血干细胞的单核-巨噬细胞前体分化而成的唯一具有骨吸收活性的多核细胞，在骨微环境的动态平衡中发挥着举足轻重的作用。转录因子在破骨细胞分化过程中扮演着不可或缺的角色，而 miRNAs 的靶分子大多是在生长发育或细胞分化中起重要作用的转录因子 mRNA.

　　Sugatani 等[6]在破骨前体细胞中利用 siRNA 干扰 miRNAs 合成的重要因子 DGCR8 （ digeorge syn-drome critical region gene 8 ） 、Dicer、Ago2 （ argo-naute2） ,miR-223 生成明显减少，显着降低破骨细胞相关转录因子表达并阻遏破骨细胞形成，从而抑制骨吸收。在最新的一项研究中，Sugatani 等[7]发现 DGCR8 敲除的破骨细胞特征性标记物和关键转录因子均受到抑制，而在 CD11b+-cre / Dicer KO 小鼠中，成骨细胞数量和活性并未受影响，但因破骨细胞数量和活性的下降，导致骨硬化病的发生，再次证明参与 miRNAs 合成的 DGCR8 对破骨细胞分化的重要性。Mizoguchi 等[8]发现 cathepsin K-cre/Dicer KO 小鼠体内和体外形成的破骨细胞数量及活性下降，骨组织 RT-PCR 显示 TRAP （ tartrate-re-sistant acid phosphatase） 、NFATc1 （ nuclear factor ofactivated T cells 1 ） 、Ephrinb2 受到不同程度的抑制； BMMs （ bone marrow-derived macrophages/mon-ocytes） 经 RANKL （ receptor activator of nuclear fac-tor kappa-B ligand） 诱导 24 h 后，Dicer KO 组 miR-155 显着下降。研究结果证明这些因子在 miRNAs的生物合成中发挥着重要作用，从而影响破骨细胞的分化。

　　Sugatani 等[9]2007 年发现破骨细胞中 miR-223表达低于破骨前体细胞，且 pre-miR-223 过表达可以完全抑制 RAW264. 7 向破骨细胞分化。另一项研究却发现，瞬时转染反义 miR-223 的 RAW264. 7显着抑制向破骨细胞分化[6],提示 miR-223 对破骨细胞分化有双向调节作用，其作用方式可能与其在细胞的表达水平有关。进一步研究证明了一个正反馈通路 PU. 1/miR-223/NFI-A/M-CSFR: 即 M-CSF （ macrophage colony stimulating factor） 诱导的PU. 1 上调 miR-223,miR-223 靶向负调控 NFI-A（ nuclear factor I-A） ,NFI-A 下 调 引 起 M-CSFR（ macrophage colony-stimulating factor receptor） 表达增加，进而促进破骨细胞分化。Li 等[10]在观察抑制 miR-223 活性以治疗 CIA （ collagen-induced ar-thritis） 小鼠有效性的研究中发现，慢转 miR-223靶序列可有效抑制 miR-223 活性，进而上调 NFI-A表达，阻遏 M-CSFR 表达，降低破骨细胞数量，增加骨密度，改善类风湿症状。

　　Mann 等[11]研究了 miR-155 在 RAW264. 7 细胞向巨噬细胞和破骨细胞分化中的作用。向巨噬细胞分化时 miR-155 表达显着上调，向破骨细胞分化时miR-155 表达明显下调。在 RAW264. 7 中过表达miR-155,可显着抑制 TRAP+破骨细胞数量和骨吸收活性，并可影响破骨细胞早期的融合，证实miR-155 在调控破骨细胞分化中发挥着重要作用。

　　在后续的实验中，过表达 miR-155 可抑制 GPNMB、MITF （ microphthalmia-associated transcription fac-tor） 、PU. 1 等表达； 而通过干预使 MITF 过表达则可修复 GPNMB 的 mRNA 表达，荧光素酶活性报告支持 miR-155 与 MITF 的 3'UTR 配对。此项研究证明了 miR-155 可以通过下调 MITF 和 PU. 1 而抑制GPNMB 和 TRAP 表达，从而阻遏破骨细胞分化及骨吸收活性，促进巨噬细胞分化。Zhang 等[12]在研究干扰素 β 抑制破骨细胞分化的实验中发现，干扰素 β 可诱导 miR-155 上调，而 miR-155 可靶向抑制 MITF 和 SOCS1 （ suppressor of cytokine signa-ling 1） 表达以抑制破骨细胞分化。以上研究都表明 miR-155 在破骨细胞分化过程中的重要作用。

　　Sugatani 等[13]在研究 RANKL 诱导 BMMs 向破骨细胞分化的 miRNA 表达谱时，发现有 33 个miRNAs 下调，38 个 miRNAs 上调，miR-21 是两个显着上调的 miRNAs 之一。c-Fos 和 PU. 1 可以诱导miR-21 生成，通过 ChIP （ chromatin immunoprecipi-tation） 证实 c-Fos 可与 miR-21 启动子结合。正常表达 miR-21 的细胞中 PDCD4 （ programmed celldeath 4） 没有蛋白表达，却有 mRNA 表达，而在慢转反义 miR-21 的细胞中具有 PDCD4 蛋白表达，提示 miR-21 可以通过转录后负向调节靶基因 PD-CD4 的表达。以上研究结果揭示了调控骨髓源性单核巨噬细胞系向破骨细胞分化中 c-Fos/miR-21/PDCD4 这一正反馈通路。Mizoguchi 等[14]通过对 RANKL 和未经 RANKL诱导 的 BMMs 行 miRNA 阵 列 分 析，miR-31 在RANKL 诱导 24h 后显着上调，提示 miR-31 可能参与破骨细胞的分化。当使用miR-31 拮抗剂时，Phal-loidin 染色显示 actin 环受到损坏呈簇状小环，而利用 RhoA 抑制剂可以修复miR-31 拮抗剂对actin 环的损伤，显示 RhoA 为 miR-31 靶基因。在分析 TNF-α（ tumor necrosis factor alpha） 对破骨细胞分化影响时，Kagiya 等[15]通过对 TNFα 和 RANKL 共处理和单独 RANKL 处理 RAW264. 7 细胞行 miRNA 阵列比较显示，新发现一个 miR-378 在破骨细胞分化过程中上调，共处理组以 miR-21、miR-29b、miR-146a、miR-155 和 miR-210 上调最为显着。

　　Lee 等[16]采用 qRT-PCR 研究发现 miR-124 表达可随 BMMs 经 RANKL 诱导时间的延长而降低，TargetScan 显示人和小鼠 NFATc1 的 3' UTR 可与miR-124 完全匹配，细胞实验显示转染 pre-miR-124 可以明显抑制 NFATc1 蛋白表达，而过表达NFATc1 可以修复 miR-124 对破骨细胞的阻遏作用。后续实验还发现，miR-124 还可能通过上调DC-STAMP 影响细胞融合，下调 RhoA 和 Rac1 可抑制破骨前体细胞的增殖和迁移能力。

　　Guo 等[17]发现破骨细胞分化过程中 miR-125a表达逐渐降低，过表达 miR-125a 可以抑制破骨细胞分化，而抑制 miR-125a 表达则促进破骨细胞分化。

　　靶基因软件预测显示 TRAF6 （ TNF receptor-associat-ed factor 6） 的 3' UTR 可与 miR-125a 不完全匹配，经荧光素酶报告基因实验证实 miR-125a 靶基因为TRAF6.EMSA 和 ChIP 显示 NFATc1 可与 miR-125a的启动子结合抑制其生成，过表达 NFATc1 可以抑制 miR-125a 生成，而沉默 NFATc1 表达则增加 miR-125a 生成。以上结果阐述了一个 TRAF6 / NFATc1 /miR-125a 生物反馈过程，即： RANKL 与破骨细胞质膜上的 RANK （ receptor activator of nuclear factorkappa-B） 结合诱导 TRAF6 表达，TRAF6 引发上调的NFATc1 阻遏miR-125a 生成，而miR-125a 则在转录后水平抑制 TRAF6 的蛋白表达。

　　miRNAs 与破骨细胞分化相关的骨代谢疾病研究证明 miRNAs 参与破骨细胞分化的调控，而破骨细胞分化状态的异常是绝经后骨质疏松症、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨肿瘤形成和肿瘤骨转移等骨代谢疾病发生的重要病因机制。Ou 等[18]利用深度测序和 iTRAQ 蛋白组学分析了 CLCN7（ A > G） 突变骨质疏松患者的外周血单核细胞，显示差异表达的 miRNAs 有 123 种，蛋白质有 173种，生物信息学分析发现 miR-320a 与 ARF1 （ ADPribosylation factor 1） 有一一对应关系，293T 细胞进一步证实了 miR-320a 可反向调控 ARF1.Wang等[19]在胫骨平台骨折预后影响因素的研究中发现，阻遏 miR-9 和 miR-181a 可以促进破骨前体细胞RAW264. 7 的迁移能力和破骨细胞的存活率。

　　Sugatani 等[20]发现雌激素可抑制 miR-21 生成，造成上调的 FasL （ fas ligand） 与 Fas 结合，介导破骨细胞的凋亡。而绝经后雌激素匮乏可引起 miR-21过表达致破骨细胞凋亡减少、骨吸收过度活跃。

　　Wang 等[21]研究发现低 BMD 的绝经后妇女 PBMCs（ peripheral blood mononuclear cells） 中 miR-133a 表达上调，提示人外周血单核细胞中 miR-133a 可促进其向破骨细胞分化，可能是绝经后骨质疏松症发生的一个重要机制。Cao 等[22]最近对于白种人的类似研究中也发现，低 BMD 的绝经后妇女 miR-422a 表达明显上调，提示了 miR-422a 作为绝经后骨质疏松生物标志物的可能性。此外，Chen 等[23]应用 miR-NA 芯片和 qRT-PCR 验证发现绝经后骨质疏松症患者 CD14+PBMCs 中 miRNAs 表达谱的差异，其中以miR-503 表达下调最为明显，骨量正常的绝经后女性 CD14+PBMCs 可 表达 miR-503,降低 NFATc1mRNA 以抑制破骨细胞分化； 而抑制 miR-503 表达则可明显上调 NFATc1 mRNA 表达、促进破骨细胞分化。动物实验结果也提示： 正常小鼠中抑制 miR-503 表达可导致骨吸收增强、骨量下降、骨微结构破坏； 而在去卵巢小鼠中恢复 miR-503 表达可导致骨密度增加、骨微结构改善。RNA22 预测并经荧光素酶报告基因显示 miR-503 可与 RANK 的 3'UTR 不完全匹配，抑制 RANK 的翻译。

　　Nakasa 等[24]在研究 PBMCs 中 miRNA 的表达水平与类风湿性关节炎骨破坏关系时发现，转染ds-miR146a 可抑制 c-Jun、PU. 1、NFATc1 的表达，降低 TRAP （ + ） 破骨细胞数量和骨吸收面积。免疫荧光显示转染 ds-miR146a 组 TRAF6 荧光基本湮灭，提示 miR146a 可通过调节 TRAF6 表达来阻遏破骨细胞分化。Pauley 等[25]比较了正常人与类风湿患者 PBMCs miRNAs 表达情况，发现在类风湿患者 PBMCs 中 miR146a、miR-155、miR-132 和 miR-16 高表达，提示这些 miRNAs 可能通过介导破骨细胞分化能力影响类风湿骨破坏的进展。此外，研究证明，系统性红斑狼疮患者 PBMCs 的 miR-148a 表达上调。Cheng 等[26]应用 miRNA 微阵列及 qRT-PCR 验 证， 发 现 CD14+PBMCs 经 M-CSF 和RANKL 诱导 14 d 后，在向破骨细胞分化中有 27个 miRNAs 表达发生变化，其中以 miR-148a 表达上调最显着且随着诱导时间延长而增加。靶基因预测软件预测并经荧光素酶报告基因检测，MAFB（ V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogenehomolog B） 为 miR-148a 的靶基因，miR-148a 与MAFB 的 3'UTR 结合，在转录后水平抑制 MAFB 翻译，间接促进 NFATc1 表达，促进破骨细胞分化。

　　动物实验也表明，静脉注射 anti-miR-148a 可以抑制骨吸收、增加骨量。

　　在研究破骨细胞与原发性骨质疏松症以及肿瘤骨转移的关系时，Krzeszinski 等[27]发现过表达 miR-34a 的小鼠表现为低骨吸收和高骨量状态，对于去卵巢以及乳腺癌/皮肤癌骨转移的骨质疏松动物给予miR-34a 纳米颗粒治疗后后可使模型动物的骨质疏松症状有效缓解，研究表明 Tgif2 （ transforminggrowth factor-β-induced factor 2） 为 miR-34a 的直接靶基因，miR-34a 作为抑制破骨细胞分化的强有力因子，有望成为防治骨质疏松相关疾病的潜在靶点。

　　为了探讨肿瘤骨转移溶骨性破坏的机制，Ell等[28]采用共培养方法发现高转移性肿瘤细胞可有效激活 RAW264. 7 向破骨细胞分化，行 miRNA 表达谱显示 RAW264. 7 的 miR-33a、miR-133a、miR-141、 miR- 190、 miR- 219 表 达 下 调。 若 在RAW264. 7 中过表达上述 miRNAs, 则 NFATc1、cathepsin K 蛋白表达下降，破骨细胞数与骨吸收面积均受到不同程度抑制。动物实验显示，过表达上述 miRNAs 可导致骨体积、骨小梁厚度和破骨细胞数的下降。在研究多发性骨髓瘤的破骨细胞分化时，Rossi 等[29]发现，miR-29b 可通过负向调控 c-Fos 和 MMP2 （ matrix metalloproteinase 2） 表达来抑制破骨前体细胞 CD14+PBMCs 向破骨细胞分化。

　　但 Franceschetti 等[30]发现 miR-29a/b/c 可以促进BMMs 和 RAW264. 7 向 破 骨 细 胞 分 化， 而 拮 抗miR-29 可以抑制破骨细胞形成。生物信息学及荧光素酶活性验证 CTR、CDC42、SRGAP2、GPR85、CD93、NFI-A 为 miR-29 的靶基因。

　　此外，还有部分 miRNAs 可以通过改变成骨细胞分泌的 OPG （ osteoprotegerin） /RANKL 比例，间接调控破骨细胞的分化来影响骨代谢疾病的进程。如 miR-34c 可通过 Notch 信号通路降低成骨细胞分泌的 OPG/RANKL 比例来促进破骨细胞分化[31]; miR-29a 可通过 Wnt 信号通路直接促进成骨细胞分化，并抑制成骨细胞 RANKL 分泌，间接抑制破骨细胞的分化成熟，改善糖皮质激素治疗引起的骨质疏松症[32].

　　展 望
　　
　　在破骨细胞分化中发现的差异表达 miRNAs 可为认识破骨细胞异常导致骨代谢性疾病的发生机制提供新的研究思路，但目前对 miRNAs 调控破骨细胞分化和活性的研究仍显薄弱，今后的研究应关注破骨细胞 miRNAs 与靶基因形成的分子调控网络，为破骨细胞相关疾病的致病机制和干预研究奠定基础。此外，miRNAs 基因治疗的载体安全性、靶向定位性、方式效率性等方面研究也将是探讨骨代谢相关疾病临床治疗新方法的关键。