肠道病毒71型国家疫苗质控标准品研制和应用

　　自 1998 年肠道病毒 71 型在中国台湾地区引起手足口病暴发以来，HFMD 在世界范围呈流行态势，特别在西太平洋地区呈持续高流行态势[1 -5].

　　中国 2008 年-2014 年 11 月，累积报告 HFMD 11 748 976例，死亡 3 210 例，其中约 90% 的重症及死亡病例由 EV71 引起[6].由于缺乏有效的治疗手段，研发疫苗成为 HFMD 防控的重点。EV71 疫苗研发的种类包括全病毒灭活疫苗[7 -10]、减毒活疫苗[11]、病毒样颗粒（ VLP） 疫苗[12 -13]及 VP1 亚单位疫苗[14]等，其中研制全病毒灭活疫苗的进展较快。

　　中国已有 3 家单位研制的疫苗完成 III 期临床试验，这些疫苗预防 EV71 相关 HFMD 的保护率均在90%以上，预防 EV71 相关疾病的保护率均在 80% 以上[15 -17].

　　准确定量疫苗抗原活性是疫苗工艺优化、质量一致性的保证，也是疫苗免疫原性和保护效果评价以及疫苗剂量确定的关键指标。因此，在 EV71 疫苗研发中，各企业均开发了针对其疫苗抗原活性的检测试剂，用于各自抗原活性的定量测定和疫苗剂量的确定。为统一和规范 EV71 抗原检测方法和剂量单位，中国食品药品检定研究院（ National Institu-tes for Food and Drug Control,NIFDC） 联合研发企业，研制了第一代国家 EV71 疫苗抗原定量标准品，保证 EV71 抗原活性定量的准确性，推动了疫苗的研发进程[18].随着 EV71 疫苗即将批准上市，该疫苗还将面临国际化市场的需求，同时 EV71 VLP 疫苗及 EV71/CA16 双价疫苗的研发进展迅速，这些都提出了研制 WHO EV71 疫苗抗原标准品的需求。

　　本文总结了与抗原质控相关的 EV71 病原学、EV71疫苗结构、检测试剂的特性、标准品应用进展，并提出疫苗抗原质控进一步研究的思路。

　　1 EV71 病原学

　　1969 年首次在美国分离成功 EV71[19].EV71属于小 RNA 病毒科肠道病毒属，为单股正链 RNA病毒。基因组由 7 400 多个核苷酸构成，只有 1 个开放读码框架，编码 2 194 个氨基酸的多聚蛋白，可进一步水解为 P1、P2、P3 共 3 个蛋白前体。P1 前体蛋白编码 VP1、VP2、VP3、VP4 共 4 个病毒衣壳蛋白。其中 VP1、VP2、VP3 结构蛋白暴露于病毒颗粒表面，VP4 位于病毒颗粒衣壳的内部[20].目前，EV71 根据基因序列分为 11 个亚型，分别为 A、B1-B5、C1-C5[21].其中 2005 年后世界范围流行的基因型主要为 C2、C4、C5、B4 和 B5,但是在中国内地1998 年后流行株均为 C4,因此中国企业研发的疫苗均采用 C4 型毒株作为疫苗株。研制对不同基因型毒株和疫苗抗原具有均匀检测能力的通用抗原检测试剂，对建立标准品及疫苗质控均具有实际意义。

　　2 EV71 疫苗的结构研究

　　Liu 等[22]学者首先发现 EV71 灭活纯化疫苗中存在实心（ F） 和空心（ E） 颗粒两种组成成分。F 颗粒为成熟的病毒颗粒，含病毒核酸； E 颗粒为装配不成熟的病毒颗粒，不含病毒核酸。F 颗粒（ 150 S） 含VP1、VP2、VP3 和 VP4,与脊灰病毒的保护性 D 抗原（ 160 S） 类似； E 颗粒（ 82 S） 含 VP0、VP1 和 VP3,与脊灰病毒的 C 抗原（ 80 S） 类似。研究表明，F 颗粒的免疫原性显着高于 E 颗粒，但 E 颗粒也可诱导一定的抗体应答[22].对 E 颗粒与免疫原性的关联尚不清晰，因为目前的纯化方法无法完全有效的区分F 和 E 两种颗粒，即无法排除微量 F 颗粒的免疫原性作用。由于疫苗生产过程中工艺变化可能导致在成品中 F 与 E 颗粒比例发生变化，因此为保证疫苗质量的批间一致性，需进一步研究准确检测 F、E 抗原颗粒的方法。

　　应用针对不同表位的单抗，检测 EV71 疫苗各工艺阶段抗原，可详细了解疫苗所包含的表位即抗原决定簇的变化和差异，不仅有助于建立疫苗抗原质控检测方法，且有助于了解 EV71 病毒黏附感染细胞的机制。有研究利用多肽文库进行了 EV71 中和表位的筛选，认为 EV71 病毒中和表位在 VP1（ aa164 ~ 178,209 ~ 223）[23].另有研究发现1 株 EV71中和性单抗的识别表位为 VP1（ aa 240 ~ 260）[24].

　　台湾地区的学者研究 2 种中和性单抗识别的表位分别位于 VP1（ aa 215 ~232） 和 VP2（ aa 136 ~151） ,并应用 VP2 单抗制备了 Q-ELISA（ 定量酶联免疫） 试剂盒，对疫苗生产的不同阶段进行质量控制[25-26].新加 坡 学 者 报 道 VP1 的 215 ~ 219 位 氨 基 酸（ KQEKD） 为线性中和性单抗的识别表位[27].目前缺乏对 EV71 构象型中和表位的研究，而构象型的中和表位可能对于中和抗体的产生更加重要。前期研究结果提示 VP1 区和 VP2 区氨基酸间，可能存在一个构象型中和表位（ 未发表资料） ,而明确构象性表位对检测抗原活性具有重要意义。因此，应考虑如何依据 EV71 单抗及多抗的特性，优化配比获得对不同种类疫苗抗原反应均一的检测试剂。

　　3 EV71 疫苗抗原检测的试剂研究

　　目前，世界范围内共有 5 家机构研发的 EV71疫苗进入或完成临床试验，分别为中国医学科学院生物学研究所（ 昆明所） 、北京微谷生物医药有限公司（ 微谷公司） 、北京科兴生物制品有限公司（ 科兴公司） 、台湾国立健康研究所（ National Health Re-search Institute,NHRI） 和新加坡 Inviragen 公司。其中，中国内陆的 3 家机构研发的 EV71 疫苗均已完成 III 期临床试验，台湾地区和新加坡机构研发的EV71 疫苗尚处于 I - II 期临床试验阶段。虽然以上5 家机构研发的疫苗均为全病毒灭活疫苗，但是研发初期每家疫苗的临床剂量单位不同，缺乏可比性。

　　昆明所和微谷公司、台湾及新加坡的研发机构研制的 EV71 疫苗 ELISA 抗原定量检测试剂，均以 EV71多抗血清用作包被抗体和标记的信号抗体[28],昆明所据此将疫苗剂量定为 EU; 微谷公司则采用微克（ μg） 单位作为疫苗剂量。而北京科兴生物制品有限公司（ 科兴公司） 研发的 ELISA 试剂以 EV71 多抗血清包被，用标记的中和性单抗检测[29],将疫苗剂量定为 KU.中国内陆 3 家企业研发的试剂分别应用于各自企业 EV71 疫苗抗原的质控和评价。此外，为建立疫苗效力试验的替代方法，台湾地区NHRI 研发了 EV71 疫苗抗原活性定量检测方法（ VP2-based Q-ELISA） ,该 Q-ELISA 方法用以检测EV71 VP aa2 ~ 28 抗原（ VP2: aa136 ~ 150 ） ,显示了与疫苗免疫原性间呈剂量效应关系[25 -26].

　　4 EV71 国家疫苗质控标准品研制和应用
　　
　　为加速中国 EV71 疫苗的研发进程，在国家科技支撑项目等课题的支持下，NIFDC 联合科兴公司、昆明所、微谷公司和华兰生物工程股份有限公司等企业，开展第一代国家 EV71 疫苗抗原定量标准品的研制。按 WHO 以及《中国药典》的相关要求制备一批疫苗原液，经配制、分装、冻干后制成候选标准品，通过检定，其分装均一性、水分和无菌检查等指标均符合要求，稳定性良好。经协作标定将 EV71疫苗抗原国家标准品标示量赋值为 1 600 U/mL.

　　为了进一步了解该标准品的适用性，由中国国内其他 EV71 疫苗研发企业应用该标准品进行了检测，结果表明该疫苗标准品适用于不同企业、不同种类EV71 疫苗抗原的定量检测。在疫苗临床试验阶段，应用 NIFDC 建立的国家 EV71 疫苗抗原定量标准品，3 个企业将疫苗剂量均改为 U/剂，达到了不同企业剂量单位的统一[15-17].通过 I 期和 II 期临床试验，昆明所、微谷公司和科兴公司分别确定了 III 期临床试验疫苗保护效果剂量为 100 U/剂、320 U/剂和 400 U/剂，其相应的蛋白含量为 2. 0 μg/剂，0. 5μg/剂和 1. 0 μg/剂。不同机构的疫苗株不同，应用的抗原检测试剂盒不同，提示疫苗的抗原比活（ 抗原活性/蛋白含量） 可作为另一抗原检测的主要检测指标。

　　疫苗抗原活性与纯度密切相关。为保证中国领先研发的 EV71 疫苗的高标准和高水平，国家审评中心和 NIFDC 统一规范了 EV71 疫苗质控标准，在EV71 灭活疫苗纯度检测中，参照重组基因工程疫苗的经验，新增了纯度检测的 HPLC 方法，标准统一规定为纯度不低于 95. 0%.增加了 EV71 抗原含量和蛋白含量质控标准； 建立的国家抗原标准物质可应用于定量 EV71 抗原含量，以及成品相对效力项目检测。达到了中国内陆 3 种进入 EV71 疫苗临床试验的抗原质控标准统一和规范化，为疫苗的审评和应用提供了基础。

　　5 小结及前瞻

　　单价 EV71 灭活疫苗的临床试验结果，以及EV71 / CA16 双价疫苗临床前研究结果，为预防HFMD 暴发或流行提供了一定的手段。疫苗抗原含量是疫苗质控和剂量确定的关键指标。已建立的中国第一代国家抗原标准品，统一了不同企业的疫苗剂量单位，促进了 EV71 疫苗的研发进程，体现了监管科学在疫苗研发中的作用[18].随着疫苗的上市以及即将到来的国际化市场需求，研制 WHO 抗原定量标准品是下一步工作的重点。应寻找针对不同基因型毒株及对疫苗亲和力一致的单抗，建立对不同疫苗毒株以及疫苗抗原活性检测能力均一的标准化抗原检测试剂，同时应进一步关注 E 或 F 颗粒的特异性单抗，探讨 F 颗粒的检测方法，从而保证疫苗抗原活性测定的准确性和可比性，推动 EV71 疫苗的研发和全球应用。