大鼠纹状体神经细胞对慢病毒的响应

　　摘要：目的:研究慢病毒对大鼠纹状体神经细胞的影响。方法:开颅分离取出大鼠纹状体、慢病毒转染靶细胞、电子显微镜观察。结果:慢病毒感染大鼠纹状体的电子显微镜显示部分纹状体神经细胞出现核变小、固缩、染色质浓集等细胞凋亡的特征性改变。

　　关键词：慢病毒; 大鼠; 纹状体神经元细胞;

　　作者简介： 罗英, 硕士研究生, 研究方向:金属毒理学。; *高毅, 助教, 研究方向:预防医学。;

　　纹状体在控制人体运动功能中起重要作用，纹状体细胞的变性可以导致机体出现严重的运动障碍。更具体地说，先前的研究已经证明了患者纹状体神经细胞的变化导致多巴胺失调引起一系列运动障碍，比如帕金森病[1]。通过逆转录病毒载体稳定感染有丝分裂后的神经元通常是难治的[2]，本次实验旨在探讨慢病毒对大鼠纹状体神经细胞的影响。

　　1 实验材料与方法

　　1.1 材料

　　细胞：大鼠纹状体细胞；慢病毒液；DMEM+10%胎牛血清；0.25%Trypsin；荧光显微镜；生物安全柜；CO2培养箱；离心机。

　　1.2 方法

　　1.2.1 取14-15天的SD大鼠，按Messer的方法解剖出纹状体；机械打碎，培养在涂有collagen的细胞培养皿内。

　　1.2.2 慢病毒感染靶细胞。

　　第一天，接种靶细胞于3.5cm的培养皿中（对照组和处理组）。

　　第二天，感染前，慢病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/ml Polybrene的新鲜培养基按合适的MOI值稀释病毒原液，吸除处理组原有的培养基，将含有慢病毒的稀释液加到处理组细胞中。

　　第四天，更换培养液，在感染48小时后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液，35℃，5%CO2培养。

　　2 结果

　　在感染慢病毒的纹状体神经细胞处理组中, 慢病毒感染大鼠纹状体的电子显微镜显示部分纹状体神经细胞出现核变小、固缩, 染色质浓集等细胞凋亡的特征性改变。结论：慢病毒会破坏纹状体神经元细胞结构，可致大鼠纹状体神经细胞出现程度不同的细胞凋亡。

　　对照组1 0 0×慢病毒感染组 (明场) 100×慢病毒感染组 (荧光) 100×  

　　3 讨论

　　慢病毒载体是目前基因治疗中载体研究的热点，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，能在体内较长期稳定的表达，安全性好[3]。本研究成功构建了过表达质粒慢病毒，荧光显微镜表明，慢病毒过表达质粒稳定转染大鼠纹状体神经细胞后，能破坏细胞结构。证实过表达慢病毒能长期稳定表达于大鼠纹状体神经元细胞，且转染效率高，有助于更深入研究潜在的作用机制。在此次实验中我们发现过表达质粒慢病毒能引起大鼠纹状体神经细胞凋亡[4]，进一步证实慢病毒感染可能与帕金森的发生发展有关[5]。

　　参考文献

　　[1]Song W, Cao Z, Lang C, et al.Disrupted functional connectivity of striatal sub-regions in Bell's palsy patients[J].NeuroImage:Clinical, 2017, 14:122-129.
　　[2] Bl?mer U, Naldini L, Kafri T, et al.Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector[J].Journal of virology, 1997, 71 (9) :6641-6649.
　　[3] Rubinson DA, Dillon CP, Kwiatkowski AV, et al.A lentivirusbased system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference[J].Nat Genet, 2003, 33 (3) :401-406.
　　[4]吴松林, 郭松超, 秦绚, 等.锰对大鼠纹状体神经细胞凋亡的影响[D].中华劳动卫生职业病杂志, 2007.
　　[5]李杏, 刘彬, 周迎春, 等.过表达HSP20的慢病毒载体对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].山东医药, 2012, 52 (15) :1-4.