新生SD大鼠神经干细胞分离培养及分化研究

　　神经干细胞是存在于神经系统内的一群具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，可以分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[1,2].近年来，神经干细胞的研究成为神经科学领域的热点之一。神经干细胞移植被认为是治疗神经系统损伤后修复和其他神经系统疾病最具前景的方案之一[3].本研究采用新生24小时内清洁级SD大鼠作为供体，分离培养神经干细胞，通过观察、检测神经干细胞向神经元、星形胶质细胞分化的生物学特性，为神经干细胞的分化研究提供更多实验依据。

　　1材料与方法
　
　　1.1实验动物

　　新生24小时内清洁2级SD大鼠，购于南方医科大学动物实验中心。

　　1.2主要试剂

　　DMEM/F12培养基，D-Hank's液（Hyclone），B27神经细胞生长添加剂（Gibco）,bFGF、EGF（Peproteeh），多聚赖氨酸（Sigma），胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司。nestin抗体购自Chemi-con公司，NF 200和GFAP抗体购自武汉博士德生物技术有限公司。台盼蓝、免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒由北京中杉生物技术有限公司提供。

　　1.3实验方法

　　1.3.1 NSCs的原代分离培养NSCs的分离：取新生24小时内清洁级SD大鼠4只，用75%乙醇消毒头部后，断头处死，在超净台内以眼科剪逐层剪开头皮及颅骨后，无菌条件下迅速取出端脑及中脑放入预冷的D-Hank's液中，去 除 脑 膜 及 血 管 后 剪 碎，加 入0.125%胰酶、0.02% EDTA液4ml,37℃消化20~30min后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基4ml终止消化，轻柔吹打至混悬液后，用400目筛网过滤，收集滤液，1000rpm离心5min,弃去上清，用D-Hank's重复清洗3遍后，加入完全培养基（含2%B27,20μg/L bFGF,20μg/L EGF的DMEM/F12培养基）重悬细胞悬液，台盼蓝染色计数后，调整细胞密度为1×106/ml接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。接种后的细胞每2~3d半量换液，培养6~7d传代1次。逐渐去除碎片及其他细胞，分离出NSCs.

　　1.3.2 NSCs的传代培养在原代培养第7天，无菌条件下进行传代培养。轻轻摇动培养瓶，用吸管将沉在瓶底而没有贴壁的神经球收集入离心管，弃去贴壁的细胞，1500rpm离 心5min,吸去上清液后，加 入NSCs完全培养基，轻柔吹打使神经球尽可能分离为单细胞悬液，计数后仍以1×106/ml接种于培养瓶中常规培养。此后每2~3d半量换液，培养6~7d传代1次。

　　1.3.3 NSCs的免疫化学鉴定取生长良好的第3代NSCs克隆球，1×105/ml接种至预先放置多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片的24孔板内，继续培养8小时，使大部分克隆球贴壁，将盖玻片取出自然晾干。

　　PBS清 洗2次，每 次5 min,用4%多 聚 甲 醛 固 定30min后，PBS清洗干净后以3% H2O2去离子水孵育10min,清洗3次，再以山羊血清封闭液37℃封闭10min.滴加一抗nestin（1∶100）,37℃孵育2小时，PBS清洗3次，每次5min,滴加二抗B液37℃孵育20min,PBS清洗3次，再滴加C液37℃孵育15min,具体步骤参照SP试剂盒说明书。

　　PBS清洗3次后DAB显色，苏木素复染，封片。对照染色以PBS代替一抗，余相同。

　　1.3.4  NSCs的诱导多向分化取含生长良好的第3代NSCs克隆球的细胞悬液，1500rpm离心5min,弃去上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液轻柔吹打为单细胞悬液后，接种于多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片的24孔板内，随时观察NSCs分化状态，继续培养7天后，进行GFAP和NF 200的免疫细胞化学染色，方法步骤同nestin.

　　2结果2.1 NSCs形态学观察及免疫细胞化学鉴定倒置显微镜下动态观察原代培养NSCs,细胞悬液接种24小时后可见大量单个大小相近的圆形细胞，细胞核大，胞质较少，折光性较高；2~3d半定量换液后可见较多悬浮生长的形态不一的细胞球，呈桑椹状，每个细胞球由数个到数十个细胞组成，折光性强，无突起生长；6~7d后，生长成由上百个细胞组成的大克隆球（图1a）。神经细胞克隆球经免疫细胞化学染色后，神经干细胞特异性表达的巢蛋白nestin呈强阳性表达，胞浆呈棕黄色（图1b）.2.2 NSCs的诱导分化将培养第3代的NSCs克隆球用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化，12小时后可见到部分NSCs克隆球紧贴细胞培养瓶，许多伪足样突起从克隆球中伸出；分化至第3天时，可见许多单个细胞逐渐从克隆球中迁出，细胞由圆形转变为有突起的细胞（图2）。培养至第7天时，细胞突起明显增多，细胞之间形成广泛的网络状结构。

　　2.3 NSCs诱导多向分化细胞的免疫细胞化学鉴定将NSCs培养至第7天时，细胞呈现多种形态，采用不同神经细胞特异性抗体进行免疫细胞化学鉴定。

　　结果显示，星形胶质细胞标记抗体GFAP在多角形胞体分化细胞的胞浆中呈阳性表达（图3a）。此类细胞从胞体伸出许多长的突起，连成网状。神经元标记抗体NF 200在卵圆形胞体分化细胞的胞浆中呈阳性表达（图3b）。该类细胞发出突起相对较少，大部分细胞发出2个细胞突起。

　　3讨论
　　
　　近年来，NSCs已被研究证实广泛分布于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统的若干区域。胚胎脑的端脑、海马、纹状体、中脑、室管膜/室管膜下区、脊髓和成年脑的脑室下区、纹状体、海马颗粒下区等已成功分离培养出NSCs[2].NSCs因其具有自我维持、自我更新、可迁徙性、转分化性、低免疫原性、多向分化潜能等生理特性，使其成为基因治疗的载体或供体细胞，且可在Ⅳ型胶原的诱导下分化为平滑肌细胞参与神经组织血管再生，为临床上脊髓损伤、帕金森病、周围神经损伤后肌肉萎缩的治疗等提供了新的思路和方法[4~7].

　　本研究从新生24小时内清洁级SD大鼠的端脑及中脑成功地分离培养了NSCs,NSCs在含有能刺激神经干细胞增殖的生长因子B27、bFGF和EGF无血清培养液中大量增殖，呈悬浮球形生长，并连续传代生长，体现NSCs自我维持和自我更新的特性。巢蛋白（nestin）是中间丝蛋白家族的成员，被列为第Ⅵ类中间丝蛋白，该蛋白主要在神经系统中的神经干细胞及神经前体细胞中表达，可以作为神经干细胞和神经前体细胞以及胰岛前体细胞的特异性标志物[8].巢蛋白的表达是暂时性的，一旦前体细胞分化成终末分化细胞 如神经元或胶质细胞，巢蛋白的表达便终止[9,10].我们的实验结果可见，经过传代培养的神经细胞克隆球nestin呈强阳性表达，表明了经传代培养的神经细胞克隆球保持了神经干细胞特性。当去除神经干细胞增殖的生长因子的作用，NSCs置 于含10%胎牛血清的DMEM/F12培 养 基 培 养3天 后，NSCs发生分化，不仅表现为细胞生长方式发生改变，由悬浮生长变为贴壁生长，而且细胞形态也发生了改变，由圆形分化为卵圆形、多角形等多种形态的有突起细胞。随着细胞的继续分化，细胞突起明显增多，分化细胞之间形成广泛的网络状结构。成熟星形胶1酸性蛋白（GFAP）和神经元标记抗体NF 200.我们采用免疫细胞化学显示，GFAP和NF200在分化细胞中呈阳性表达，表明神经干细胞经过诱导分化后，部分细胞分化为神经胶质细胞和神经元，体现了NSCs的多向分化潜能。

　　4结论

　　通过从新生SD大鼠的脑组织成功分离、培养出NSCs,并且向星形胶质细胞和神经元等方向分化，体现 了NSCs自我维持、自我更新和多向分化的基本特征。神经干细胞的体外培养为后续神经干细胞的分化研究提供了更多的实验依据，对细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究具有重要意义。