大鼠感觉神经元-背根神经节神经元原代培养纯化

　　周围神经损伤与变性疾病在临床上是较为常见的疾病，常常会累及感觉神经元-背根神经节（dorsalroot ganglion, DRG）神经元，为探究其损伤与修复机制，体外培养 DRG 神经元是重要的实验技术。目前，在 DRG 神经元的原代培养过程上，常使用阿糖胞苷（cytarabine,Ara-C）抑制神经胶质细胞的生长以纯化DRG 神经元[1-4],这种方法仍然存在一些问题：由于需要多轮纯化，获得纯度较高的 DRG 神经元需要的周期较长，同时 Ara-C 对神经元的细胞活力也有一定的影响；此外，Ara-C 试剂生产厂家不同、批号不一，会造成纯化次数不定、纯度不能保证、不同批次培养的细胞差异性较大等问题。因此，本研究对大鼠DRG 神经元原代培养中的纯化方法进行了改良，以克服传统方法的不足。

　　1材料与方法

　　1.1动物 出生 1 d（P1）的 SD 大鼠，由南通大学实验动物中心提供。动物实验已通过伦理委员会审查同意。

　　1.2试剂

　　DMEM 培养基、Neurobasal 培养基、胎牛血清（febtal bovine serum, FBS）、羊血清、0.25%胰酶和 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline,PBS 购 自 Gibco 公司；B27 和 多 聚 赖 氨 酸（poly-L-ly sine, PLL） 购自 Invitrogen 公司；牛血清白 蛋 白 （bovine serum albumin, BSA）、L - 谷 氨 酰胺、Ara-C 和Ⅰ型胶原蛋白酶购自 Sigma 公司；CCK8 购自 Dojindo 公司；其他试剂为均分析纯。

　　1.3细胞培养方法

　　1.3.1 大鼠 DRG 的取材 准备 5 只 P1 大鼠逐个取材，用 75%乙醇全身消毒大鼠后，无菌超净台内处死，剪开背部皮肤，打开脊髓腔，用显微镊小心取出双侧的 DRG,置于冰上的 DMEM 培养基中。

　　1.3.2 未改良的培养与纯化方法 所有培养板均预先用 PLL 包被待用。（1）酶解消化：DRG 加 2 mL Ⅰ型胶原酶（3 mg/mL） 37 ℃消化 30 min,小心吸去胶原酶，然后再加入 2 mL 0.25%胰酶 37 ℃消化 20 min,用含 DMEM 完全培养基（DMEM 培养基添加 10%FBS）终止消化，1 000 r/min 离心 5 min 后弃上清。（2）接种细胞：细胞沉淀重悬于 DMEM 完全培养基，过 400目筛网。细胞计数，以（2~4）×104/孔密度接种到 24 孔培养板，置于 5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱内培养，24 h 后更换为神经元培养液（Neurobasal 培养基添加 2%B27、2 mmol/L L-谷氨酰胺）培养 2 d.（3）纯化细胞：为去除神经胶质细胞，更换为神经元纯化培养液（神经元培养液添加 10 μmol/L Ara-C）培养 2 d,再用神经元培养液恢复 2 d,按此方式至少纯化2 轮后用于实验。按此方案 1 个周期至少需要 10 d[1-4].

　　1.3.3 培养与纯化步骤的改良 改良方法主要是在接种细胞这一步骤的前后分别增加不同的纯化步骤，并减少 Ara-C 纯化神经元的次数。（1）DRG 的酶解消化步骤同 1.3.2.（2）接种细胞前应用密度梯度离心法分离细胞：将 5 只 P1 大鼠的 DRG 消化后获得的细胞沉淀重悬于 5 mL 15%的 BSA 溶液（含 15%BSA 的 0.01 mol/L PBS 溶液）中[5],1 000 r/min 离心 5 min后弃上清。（3）接种细胞：用 DMEM 完全培养基重悬细胞，过 400 目筛网。细胞计数后以（1~1.5）×105/孔密度接种到 6 孔培养板。（4）接种细胞后应用差速黏附特性分离细胞：细胞接种 6~8 h 后，观察到所有细胞已完全贴壁，用移液器轻轻均匀吹打细胞，当显微镜下观察到大部分神经元细胞已被吹起而重新悬浮后，立即将含悬浮细胞的培养液转移至离心管中，1 000 r/min离心 5 min,弃上清后重悬。（5）Ara-C 纯化神经元1 次：细胞重新计数后以（2~3）×104/孔密度用含 10%FBS 的神经元培养液接种到 24 孔培养板，培养 12~16 h,用神经元纯化培养液纯化 2 d 后更换为神经元培养液，培养 24 h 后观察并用于实验。本改良方案 1 个周期仅需要 5 d.

　　1.4细胞形态学观察 采用相差显微镜观察神经元细胞及其他非神经元细胞的形态。通过 β-tubulinⅢ的免疫细胞化学（immunocytochemistry,ICC）染色，采用荧光显微镜观察 DRG 神经元形态。

　　1.5细胞纯度鉴定DRG 神经元的 β-tubulin ⅢICC 染色：4%多聚甲醛常规室温固定细胞 15 min,洗涤后室温封闭 1 h,加一抗（mouse anti-β tubulinⅢ antibody,1︰1 000,Sigma 公司） 4 ℃孵育过夜，洗涤后加二抗（TRITC goat anti-mouse,1︰200,Santa Cruz公司）室温避光孵育 2 h,洗涤后加 Hoechst33342（5 μg/mL） 37 ℃复染细胞核 8 min.洗涤后滴加荧光封片液封片。荧光显微镜下随机拍摄细胞图片，随机计数 10 个视野中的细胞总数和 β-tubulin Ⅲ的 ICC染色阳性细胞数，计数百分比。

　　1.6细胞活力检测 在 PLL 包被的 96 孔板中接种DRG 神经元，密度为 1×105/mL,每孔 100 μL,未改良组和改良组每组 10 个复孔。培养 24 h 后，每孔加入10 μL 的 CCK-8 溶液，将培养板在 37 ℃培养箱内孵育 2 h 后，用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度值。

　　1.7统计学方法 本实验中定量数据以x軃 ±s 表示，应用 GraphPad Prism5 软件分析数据，单因素两组间采用 T-Test 配对资料分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2结 果

　　2.1改良步骤的效果 根据神经元和神经胶质细胞的体积与密度的差异，使用 15%BSA 溶液密度梯度离心法，明显去除了许多细胞碎片和体积较小的神经胶质细胞；接种培养 6~8 h 后，由于神经元细胞贴壁能力弱，轻轻地吹打即可重新悬浮起来，利用差速黏附特性进一步去除了更多贴壁能力较强的神经胶质细胞；最后，应用 Ara-C 抑制神经胶质细胞在神经元培养液中的生长，使神经元得到进一步的纯化。通常每 5 只 P1 大鼠取材，可获得（1~1.5）×105个高纯度DRG 神经元用于实验。

　　2.2 DRG神经元形态学的比较 相差显微镜观察。可见，未改良组神经元（图 1A,1C）胞体有一定透亮度和折光性，突起分支十分茂密，可见不少神经胶质细胞及细胞碎片；改良组神经元（图 1B,1D）胞体更加透亮、呈圆形或椭圆形、折光性好，突起分支相互交织成网，神经胶质细胞明显减少。荧光显微镜观察可见神经元胞体和突起均表达 β-tubulin Ⅲ，未改良组神经元（图 2A,2C,见封二）突起分支茂密，可见不少非神经元细胞核；改良组神经元（图 2B,2D,见封二）突起分支清晰，非神经元细胞核明显减少。

　　2.3 DRG神经元纯度的比较 与未改良组比较，改良组的 β-tubulin Ⅲ阳性细胞比例达到 93%,未改良组纯度仅达到 68%,差异有统计学意义（P<0.05）（图3A）。

　　2.4 DRG神经元细胞活力的比较CCK-8 检测结果显示改良组细胞活力高于未改良组，差异有统计学意义（P<0.05）。

　　3讨 论

　　本实验根据神经元和神经胶质细胞的体积与密度的差异，使用 15%BSA 溶液密度梯度离心法，明显去除了许多细胞碎片和体积较小的神经胶质细胞；利用差速黏附特性进一步去除贴壁能力较强的神经胶质细胞；再应用 Ara-C 抑制神经胶质细胞在神经元培养条件下的生长达到进一步纯化的目的。以上3 种细胞纯化方法的联合应用，显着缩短了 DRG 神经元的培养周期，并明显提高神经元纯度，且保证细胞的良好活力，为进一步开展实验研究奠定了技术基础。

　　在体外实验研究中，常常需要大量高纯度的DRG 神经元细胞，以排除神经胶质细胞给实验数据带来的影响，尤其是 DRG 中含量较多的施万细胞。

　　已有文献[6-10]报道施万细胞可分泌多种功能性营养有因子，包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源神经营养因子、睫状神经营养因子、胰岛素样生长因子 1 和神经营养因子-3/4/5 等；还可以释放促血管生成因子，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管生成素-1 等，这些功能性营养因子和促血管生成因子对神经元的存活和轴突的生长起重要作用。另外，施万细胞还具有体外成髓鞘的潜能[11-12],可促进受损神经元的功能恢复。

　　因此，为排除神经胶质细胞对体外实验结果的影响，实验者必须培养出高纯度的 DRG 神经元，才能揭示其损伤后的变化与机制，并进一步探究各种干预手段对 DRG 神经元所起的保护或修复作用及机制。