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大鼠月龄增长下内皮素-1在神经细胞的变化

来源:学术堂 作者:姚老师
发布于:2015-10-24 共2434字
摘要

  衰老是导致神经系统退化性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病的主要危险因素,也是脑血管病发病率、病死率明显增加的主要因素,而纹状体又是脑血管意外最常发生的部位。内皮素(endothelin,ET) 是Yanagisawa 等[1]从猪主动脉内皮细胞培养液中分离纯化出的一种具有强烈缩血管作用的生物活性肽。

  ET 不能透过血脑屏障,而研究表明在中枢神经系统、周围神经系统神经节细胞中都有 ET、ET mRNA的广泛分布,故大脑中出现的 ET 只能是脑组织自身合成的[2].ET-1 作为强血管收缩因子,对于维持血管稳态有着重要的作用[3].ET-1 表达异常与高血压、动脉粥样硬化、心血管病、肿瘤的发生有关[4-6].

  内皮素还与脑血管痉挛、脑缺血、脑梗死、脑出血的发生、发展有密切的关系。观察随着大鼠月龄增加ET-1 在神经细胞的变化规律,为揭示纹状体易发生卒中的原因、临床治疗及脑血管病发病机制提供佐证。

  1 材料与方法

  1. 1 动物与分组 健康 Wistar 大鼠 36 只,雌雄不拘,按不同月龄分 3 组,第 1 组为 1 ~ 2 个月龄大鼠(80 ~120 g) 、第 2 组为 6 ~7 个月龄大鼠(300 ~400g) 、第 3 组为 > 24 个月龄大鼠(450 ~ 600 g) ,每组各 12 只。

  1. 2 方法

  1. 2. 1 免疫组化 用 1% 戊巴比妥钠(3 mg / kg) 腹腔注射麻醉,主动脉插管,生理盐水灌注至流出液体变清亮,然后立即注入 4 ℃ 的 Zambonis 固定液,灌注后将大鼠放入 4 ℃冰箱 1 ~2 h,取出脑组织移入20% 蔗糖中,直至样本沉入瓶底。冰冻切片(30 μm)收集在 0. 01 mol/L 磷酸盐缓冲液(phosphate buffe-red saline,PBS) 备用。每个样本随机选取 8 张切片,根据链霉亲和素-生物素复合物试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司) 染色步骤进行染色。鼠抗ET-1 工作浓度 1∶ 1 000 (美国 Sigma 公司) ; 二抗生物素化抗鼠免疫球蛋白 G,工作浓度 1∶ 100(武汉博士德生物工程有限公司) ; 三抗链霉亲和素-生物素复合物,工作浓度1∶ 100(武汉博士德生物工程有限公司) .对照组用正常山羊血清替代一抗反应。

  1. 2. 2 染色 免疫组化染色判断标准,无着色为阴性、淡黄色为弱阳性、棕黄色为中等阳性、深棕黄色为强阳性。所有切片,每张切片随机选 5 个高倍视野(×200) 进行摄片,计数免疫组化标志定位准确的阳性细胞占所有细胞的比例并记分。细胞质或细胞核阳性细胞数占所有细胞数的 25% 以下为 ± 、25% ~ 49% 为 + 、50% ~ 75% 为 + + 、75% 以上为 ++ + ,依次记为 1、2、3、4 分; 染色强度弱阳性、中等阳性、强阳性依次以 ± 、+ 、+ + 表示,记为 1、2、3分; 最后计算 2 种记分的乘积。表达强度评分和观察结果评分的乘积为表达强度。阳性表达判定标准为表达强度综合得分 > 4 分[7].除了检测纹状体ET-1 免疫反应阳性细胞外,还对颞叶皮质、海马区ET-1 反应强度进行了检测。

  1. 3 统计学处理 应用 SPSS 10. 0 软件,计量资料用均数 ± 标准差(x珋 ± s) 表示,组间比较采用 t 检验,P < 0. 05为差异有统计学意义。

  2 结果

  ET-1 主要在细胞质表达,随着大鼠月龄的增加,纹状体阳性细胞增多(图 1) ,ET-1 的表达也随之增强。同月龄的大鼠脑不同部位 ET-1 表达差异无统计学意义(P >0. 05) .颞叶皮质、海马区 ET-1 的表达也随着大鼠月龄的增加而增加。 > 24 个月龄组不同部位 ET-1 阳性反应强度与其他 2 组比较差异有统计学意义(P <0. 01) .见表 1.

  3 讨论

  ET-1 由大内皮素经内皮素转化酶裂解合成,是ET 家族的主要成员之一,也是至今发现的最强的缩血管物质,且作用持久。ET-1 主要通过结合相应受体而发挥其生物学效应,其中 ET-1 A 受体对 ET-1有较强的选择性,主要分布于血管平滑肌,ET-1 由内皮细胞释放后通过与 ET-1 A 受体的持久结合而调节血管的收缩[8].在中枢神经系统病理、生理情况下脑组织内、脑脊液内或血浆内的 ET-1 增高,其受体表达也上调。提示 ET 系统不仅是正常生理情况下重要的血管活性肽及神经调节肽,还在中枢神经系统病理、生理过程中起重要作用。

  老化是正常的生理过程,随着大鼠月龄增加,纹状体 ET-1 阳性反应强度增加,提示 ET-1 合成增加。

  导致 ET-1 阳性反应强度增加的原因很多,脑组织缺氧可能是主要因素之一。在正常情况下,ET-1 可被内皮细胞降解。内皮细胞间的紧密连接可阻止 ET-1从管腔内漏出。因此,机体的自身调节机制可以维持 ET 的基础释放,适应生理功能的需要。ET-1 在动脉高压、慢性肾病、糖尿病患者以及实验模型超表达。随着增龄,ET-1 在老年人循环血液中增加[9],与本研究结果相一致。纤溶酶原激活物抑制剂、血管紧张素Ⅱ、凝血酶、自分泌刺激、pH 减低会刺激ET-1 释放,雌激素、心房利钠多肽、前列腺素、一氧化氮能抑制 ET-1 分泌,ET-1 又可通过 ET-1 A 受体刺激血小板聚集促进血栓形成[10].老龄大鼠神经细胞 ET-1 表达增多,可能与老龄导致动脉硬化,脑组织相对血供减少有关。老年人出现脑血管病后组织损伤及临床表现较年轻者重,可能与老龄 ET-1 在神经细胞表达增加有关; 在脑外伤、脑血管病基础上,ET-1 过量合成和释放,又进一步加重了脑组织的损伤。因此,减少 ET-1 对于减轻脑组织损伤有着重要意义。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO) 也能调节 ET-1 水平[11],缺氧与增龄能影响 ET-1 及EPO 的相互作用。在缺氧情况下 EPO 增多可减少ET-1 的释放。Schfer 等[12]发现阻断培养的老年大鼠神经胶质细胞 ET-1 A 受体后可增强 EPO mRNA及 EPO 受体活性从而降低 ET-1 分泌。因此,老年人适当补充 EPO 有可能减少增龄所致 ET-1 增加。

  有研究证实,体育锻炼能增加内皮一氧化氮释放从而减少 ET-1 生物活性,进而延迟老化过程[13-14],老年女性增加锻炼可减少循环血液的 ET-1 水平[15],锻炼也可预防随年龄增加导致血压生理性增高[13].因此,老年人适当增加锻炼,对于减少 ET-1 分泌、预防脑血管病有着重要意义。

  参考文献:
  [1] Yanagisawa M,Kurihara H,Kimura S,et al. A novel po-tent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothe-lial cells[J]. Nature,1988,332(6163) : 411-415.
  [2] 许超。 内皮素与神经系统疾病[J]. 全科医学临床与教育,2008,6(4) : 307-309.

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