米曲霉乳糖酶基因转化到毕赤酵母高效表达系统的实践

　　乳糖酶，又称 β-半乳糖苷酶，或 β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，其主要作用是将乳糖水解成能够被人体直接吸收的葡萄糖和半乳糖，从而降低乳制品中的乳糖含量，用于治疗因人体内缺乏乳糖酶导致的乳糖不耐症或提高乳制品的甜度.乳糖酶已被美国食品药品管理局（ FDA） 、《食品化学法典》（ FCC） 、世界卫生组织（ WHO） 以及联合国粮农组织（ FAO） 等权威机构认定为安全的生物酶制剂，1998 年中国卫生部也将其列入食品添加剂卫生使用标准 GB2760中，允许其在食品工业中使用.

　　乳糖酶的来源非常广泛，但只有微生物来源的乳糖酶可应用于大规模工业化生产。目前，工业生产中常用的乳糖酶制剂来源包括细菌中的乳酸菌（ Lactobacillus） 、大肠杆菌（ E. coli） 等，霉菌中的米曲霉（ Aspergillus oryzae） 、黑曲霉（ Aspergillus niger） 等和酵母中的乳酸酵母（ Lactic yeast） 、脆壁克鲁维酵母（ Kluyveromyces fragilis） 等.但是，目前乳糖酶的大规模工业化制备还存在许多问题： 首先目前市售的乳糖酶多是胞内酶，如脆壁克鲁维酵母来源的乳糖酶，纯化工艺复杂，收率低，导致乳糖酶产品售价过高，应用成本升高； 其次虽然也有胞外分泌的乳糖酶，如米曲霉、黑曲霉等，但其单位产量偏低.毕赤酵母（ Pichia pastoris）表达系统作为一种成熟的表达系统，具有蛋白表达量高、稳定性好、外源目的蛋白可分泌于胞外且含有糖基化修饰，自身分泌的蛋白少而有利于纯化等优点.本研究将通过基因工程方法克隆米曲霉乳糖酶基因，并将其转化到毕赤酵母高效表达系统中，得到产量高又可胞外分泌的乳糖酶基因工程菌株，为下一步应用于工业化生产奠定基础。

　　1 材料与方法
　　
　　1. 1 材料
　　1. 1. 1 菌株与载体 米曲霉、大肠杆菌 DH5α、大肠杆菌Top10、巴斯德毕赤酵母均由山东省生物药物研究院生物技术中心保存； pMD18-T Vector 载体，购自上海生物工程有限公司； pGAPZα A 载体，购自 Invitrogen 公司。

　　1. 1. 2 实验试剂 Trizol 试剂、DNase I（ RNase Free） 试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒、Taq DNA Polymerase、dNTPs、1 kb DNA Ladder、T4 DNA Ligase、限制性内切酶 XhoI、Xba I,均为 TaKaRa 公司产品； 普通质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒，为天根公司产品； X-gal、TEMED、10% AP、30%Acr-Bis、蛋白质 Marker,均为 Fermentas 公司产品； Zeocin,购自 Sigma 公司。

　　LB 培养基（ g / L） : 蛋白胨 10. 0、酵母提取物 5. 0、氯化钠 10. 0、琼脂 15. 0.

　　低盐 LB 培养基（ g/L） : 蛋白胨 10. 0、酵母提取物 5. 0、氯化钠 5. 0、琼脂 15. 0.

　　YPD 培养基（ g / L） : 蛋白胨 20. 0、酵母提取物 10. 0、葡萄糖 20. 0,固体培养基再增加琼脂 15. 0.

　　1. 1. 3 实验仪器 梯度 PCR 仪为 Eppendorf 公司产品；UV-2000 紫外分光光度计为尤尼柯仪器有限公司产品； 蛋白电泳仪和 GEL DOC XR 型凝胶成像仪均为 Bio-Rad 公司产品； Sunrise2 型光吸收酶标仪为 Tecan Austria 公司产品。
　　
　　1. 2 方法
　　1. 2. 1 米曲霉乳糖酶基因的提取 将 - 80 ℃ 保存的菌株在固体培养基中 30 ℃活化 48 h,参照 Trizol 使用说明书的方法提取 RNA,并采用 TaKaRa DNase I（ RNase Free） 进行处理，参照 TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 说明书进行反转录得到 cDNA.

　　根据 GenBank 中报道的米曲霉乳糖酶基因序列设计引物： 上游引物 lac-husp1（ 5'-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCT-GAAG-3‘） 和下游引物 lac-hdsp2 （ 5'-GCTCTAGATTAGTA-AGCACCCTTTCTTTG-3’） .按如下条件进行 PCR 反应扩增乳糖酶基因片段： 第一阶段 94 ℃ 变性 3 min; 第二阶段94 ℃ 变性 30 s 后，58 ℃ 复性 30 s,再 72 ℃ 延伸 3 min,共30 个循环； 第三阶段 72 ℃ 10 min,之后维持在 4 ℃ .将PCR 得到的目的基因序列与 pMD18-T Vector 载体相连接，并转入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，在含 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 固体筛选培养基平板上挑取蓝色单菌落转接LB 液体培养基振荡培养过夜，提取质粒进行 PCR 验证无误后由上海生物工程有限公司测序。

　　1. 2. 2 米曲霉乳糖酶表达载体的构建 将 PCR 得到的米曲霉乳糖酶基因片段与 pGAPZα A 表达载体分别使用内切酶 XhoI 和 XbaI 进行酶切并使用 TaKaRa 凝胶回收试剂盒回收，用 T4 DNA 连接酶在 10 μL 连接体系中 16 ℃过夜连接。然后将连接液转入大肠杆菌感受态细胞 Top10 中，涂布于含有 25 μg/mL Zeocin 的低盐 LB 固体平板上 37 ℃培养。挑取阳性单克隆菌落于 LB 液体培养基中培养后提取质粒，使用如下通用引物对其进行 PCR 验证：

　　上游引物 pGAP Forward: 5'-GTCCCTATTTCAATCAATT-GAA-3'
　　下游引物 AOX1: 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'

　　1. 2. 3 重组酵母的构建及筛选 将表达载体 pGAPZαA-lac使用内切酶 BlnI 进行酶切得到线性化的载体片段，电转化毕赤酵母 SMD1168H 菌株。具体电转化条件为 1. 5 kV 5 s,涂布于含100 μg/mL Zeocin 及40 μg/mL X-gal 的 YPD 固体平板上，培养24 h 至48 h.

　　挑取筛选平板上蓝色的单菌落接入 YPD 液体培养基中，30 ℃振荡培养，使用酵母基因组 DNA 提取试剂盒，并进行 PCR 验证。同时每 6 h 无菌条件下取菌液 1 mL,12 000 r / min 离心 5 min,取上清，做酶活性分析和 SDS-PAGE 分析。

　　1. 2. 4 乳糖酶活性的测定按照文献的方法测定乳糖酶活性。分别取浓度为 10 mol/mL 的邻硝基酚（ ONP） 溶液0,10,20,30,40,50 μL 于试管中，分别相应加入 pH 5. 2 的0. 2 mol / L 醋酸缓冲液 2 500,2 490,2 480,2 470,2 460,2 450 μL,然后向每个试管加入 5% Na2CO3溶液500 μL 混合均匀，测吸光度 A420值。以 ONP 的 μmoL 数为横坐标，A420为纵坐标绘制标准曲线。

　　取适当稀释的酶液 50 μL,加入预热的 40 μmol/mL 邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ ONPG） 底物 450 μL,60 ℃ 反应10 min,立即加入 5% Na2CO3溶液 500 μL 终止反应并显色，再加醋酸缓冲液 2 mL 至终体积 3 mL,测定 A420值。对照管反应时不加酶液，在测定吸光度前补加酶液。

　　乳糖酶酶活单位定义为： 在 60 ℃、pH 5. 2 条件下，每1 min 将 ONPG 水解产生 1 μmol ONP 所需的酶量，为一个酶活单位（ 1U） .

　　酶活计算公式（ U/mL） = X × 稀释倍数/（ 0. 05 mL ×10 min） = X × 2 × 稀释倍数X 为 ONP 的 μmoL 数。

　　2 结果
　　
　　2. 1 乳糖酶基因的克隆及表达载体的构建
　　以提取的米曲霉 cDNA 文库为模板，利用根据报道的米曲霉乳糖酶基因序列设计的两条引物，成功 PCR 扩增得到约 3 kb 的片段。根据测序结果，发现其与报道的米曲霉乳糖酶基因序列仅有 3 个氨基酸位点的差别，其同源性大于 99%,确定该序列为米曲霉乳糖酶基因序列。利用 T4DNA 连接酶将其连接到表达载体上构建含有目的片段的质粒 pGAPZαA-lac,转化入大肠杆菌 Top10.提取重组质粒，使用通用引物进行 PCR 验证，证实重组质粒含有乳糖酶基因片段（ 图 1） .

　　
　　2. 2 重组酵母的构建及筛选
　　将含有目的片段的质粒酶切线性化，电转化导入毕赤酵母细胞，构建含有米曲霉乳糖酶基因的毕赤酵母工程菌株。用 Zeocin 抗性并添加了 X-gal 的 YPD 平板筛选转化子，因含有目的基因的毕赤酵母可产生乳糖酶，将无色化合物 X-gal 切割成半乳糖和深蓝色的物质 5-溴-4-靛蓝，所以蓝色菌落的重组酵母含有目的基因序列并能够将其成功表达乳糖酶（ 图 2） .挑取蓝色单菌落接入 YPD 液体培养基培养，收集细胞并提取其基因组进行 PCR 验证结果无误。

　　
　　2. 3 目的蛋白的表达测定
　　将构建好的重组酵母 35 株（ 编号： GalC101-135） 进行摇瓶发酵并测定其半乳糖酶活性，筛选出半乳糖酶酶活最高的重组菌株 GalC131,该菌株产酶曲线见图 3.如图所示，GalC131 经 72 h 发酵后发酵液酶活可达到 530 U/mL.

　　
　　将毕赤酵母工程菌 GalC131 摇瓶发酵，每 12 h 取发酵液离心，取上清，SDS-PAGE 分析。结果显示相对分子质量约为 120 k ~130 k 的单一条带（ 图 4） ,与计算获得的米曲霉乳糖酶大小一致，而且该蛋白可成功分泌到毕赤酵母工程菌发酵液上清中。电泳图分析标明，其含量在上清液中可达 90%以上，经简单超滤、纯化后便可制得纯酶液使用。

　　
　　3 讨论
　　
　　目前工业化生产中使用的乳糖酶多来源于脆壁克鲁维酵母、米曲霉等。其中克鲁维酵母来源的乳糖酶在工业化应用提取酶蛋白时必须经过破壁等一系列操作流程，工艺复杂、收率低，导致生产成本居高不下。米曲霉、黑曲霉等来源的乳糖酶可直接分泌于胞外，纯化工艺相对简单，但单位产量很低，摇瓶发酵酶活不超过 80 U/mL.目前国内外也有使用毕赤酵母表达系统表达外源乳糖酶基因的报道，但都会采用甲醇作为诱导剂来诱导外源基因的表达，而甲醇对人体具有强毒性，误服后会对人体中枢神经系统产生麻醉，进而导致失明、肝病，甚至死亡。当前我国社会十分关注食品安全问题，乳糖酶作为我国卫生部认定的食品添加剂之一，在其生产过程中使用甲醇无疑会带来很多安全隐患。

　　米曲霉乳糖酶具有相对耐热、耐酸、稳定性高和提取方便等特点，具有良好的工业化生产前景。因此本研究采用米曲霉乳糖酶为研究对象，成功从一株米曲霉中克隆得到了乳糖酶基因，与 GeneBank 报道的序列相比具有99%以上的同源性，并首次将米曲霉乳糖酶基因在毕赤酵母表达体系中进行高效表达。经筛选最终成功得到了一株高产乳糖酶基因工程菌株 GalC131,摇瓶发酵 72 h 后上清液酶活可以达到530 U/mL 左右，远高于目前已报道在同等条件下曲霉发酵产乳糖酶水平，且目的蛋白含量可达 90% 以上，经一步简单超滤纯化后就可制成纯酶液，可大幅缩短生产流程，节约生产成本。另外本研究在构建基因工程菌株时选用了组成分泌型质粒 GAP 系列的表达载体，该表达载体GAP 启动子不需要甲醇诱导便可以高效启动外源蛋白的表达,从而杜绝了甲醇的使用。

　　综上所述，本研究将通过基因工程方法成功构建了一株既产量高又可胞外分泌、后续纯化简单、生产过程安全的新型乳糖酶生产菌株，为乳糖酶在食品等工业上的进一步大规模应用奠定基础。