动物源肠球菌的分离鉴定、药敏实验及耐药机制

　　摘    要：　肠球菌是目前主要的人畜共患条件致病菌，具有天然耐药、获得性耐药及多重耐药等特点。随着抗生素在畜牧养殖业上的大量应用，动物源肠球菌的耐药性日趋严重。本文从肠球菌的分离鉴定、药敏实验、耐药机制几方面对当前的研究进展进行综合阐述。

　　关键词：　肠球菌; 鉴定; 药敏实验; 耐药机制; 综述;

　　肠球菌是一类广泛分布于环境、人和动物消化道内的革兰氏阳性球菌，在分类学上属于肠球菌属，菌体为圆形或椭圆形，呈单个或成对或短链状状排列，无芽孢，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌[1]。肠球菌是一类人畜共患的条件致病菌，可以引起人体尿路感染、皮肤软组织感染，腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等。同样有不少报道指出，肠球菌可感染鸡、鸭、猪、牛、羊等主要食品动物，导致疾病发生[2,3,4,5]。既往，肠球菌作为肠道的正常菌群不被认为是重要的致病菌，但随着人源肠球菌感染的发生率和死亡率明显升高，美国医院感染监测系统（NISS）已把肠球菌列为医院感染的第二大病原菌[6]。据我国2010年全国细菌耐药性监测报告，肠球菌是除葡萄球菌外，临床分离率第二的革兰氏阳性菌[7]，与美国报告一致。潘航[8]等根据美国肠道细菌耐抗生素监测系统（NARMS）数据统计分析指出，在畜禽肉样品中肠球菌检出率最高（42%）。随着抗生素的发明使用，特别是养殖环节抗生素的大量使用，肠球菌的耐药性不断增强，抗生素选择范围逐渐收窄，有研究指出，肠球菌可以在人与动物之间水平传播[9]，这使得肠球菌的耐药性研究不仅仅在单一领域，而是覆盖公共卫生和农业畜牧养殖所要共同应对的问题。

　　1 、肠球菌的检测方法的研究

　　1.1 、传统细菌分离鉴定方法研究

　　综合目前现行有效的标准，肠球菌的选择性培养基包括KF链球菌琼脂培养基、肠球菌琼脂培养基和MRS琼脂：肠球菌属细菌在KF琼脂上形成暗红至粉红色菌落，在肠球菌培养基上形成带棕色环的棕黑色菌落，在MRS培养基上形成白色或乳白色菌落，菌落较小，表面光滑，边缘整齐[10,11]。在现行有效的标准中选择性培养基仅仅是一种初筛方法，需结合显微镜下的菌体形态和生化反应鉴定结果进行综合判定。除了传统的培养基外，随着科技的进一步发展和实际应用，出现更加直观的选择培养基，即显色培养基。张银旺等[12]采用血平板加传统生化鉴定和VTECK全自动细菌鉴定系统与CPS4显色培养基进行比较，显色培养基符合率在97%以上，且显色培养基直接鉴定率在85.3%，相比传统方法更简便、快速、高效。随着耐万古霉素肠球菌的出现，对耐万古霉素肠球菌的特异性检测需求日益增加，耐万古霉素肠球菌显色培养基随着出现，谷存国[13]等对血平板和耐万古霉素显色培养基（VRE ID）筛选肠球菌进行比较，两者结果基本一致，显色培养基更简便。
 

　　1.2、 分子生物学方法研究

　　分子生物学方法主要包括聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）、多位点基因测序分析（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE) Southern杂交技术、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等[14]。

　　1.2.1 、聚合酶链式反应及其衍生方法

　　1985年美国MILLER等发明了聚合酶链式反应，是一种在体外模拟自然DNA复制的核算扩增技术。该方法可以检测特异性基因片段，花费的时间少，简便高效，自20世纪80年代出现以来已被广泛用于检测，目前已成为肠球菌鉴定中常规的检测方法。在普通PCR方法上又衍生出荧光定量PCR方法(Real-time Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR）和多重PCR诊断方法。

　　1996年美国Applied Biosystems公司推出在普通PCR技术上通过添加荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物，实现实时定量功能。吴程璐[15]等建立了以引物EF1902为基础的荧光定量体系，并对肠球菌人工污染的牛奶进行检测，当初始接菌量在2.63cfu/ml时，只需增菌6h即可用该方法检测出肠球菌，52份样品中检测准确率为94.23%。金东[16]等根据屎肠球菌的保守基因—d-丙氨酸聚连接酶基因（ddl基因）设计引物和探针，建立了屎肠球菌的Taq Man荧光定量PCR方法。应用该方法检测菌浓度在1.6×100～1.6×108cfu/ml梯度间的屎肠球菌模拟样本，其检测灵敏度在1.6×102cfu/ml，检测灵敏度更高。

　　多重PCR技术可以使用两对或多对不同的引物对同一DNA模板进行扩增，以达到同时检测的目的，其敏感性和特异性可达到95.5%和98.1%[17,18]。王亚宾[19]等以肠球菌的16S r RNA基因和Sod A基因分别设计属和种的特异性引物建立多重PCR方法，同时检测屎肠球菌和粪肠球菌两种菌株，经过与16S r RNA测序方法比较，对猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株的鉴定符合率为100%。林东昉[20]等建立了基于多重PCR技术的肠球菌万古霉素高水平耐药基因van A、van B、van D和van M快速检测分型方法。检测临床分离的50株VRE，与常规PCR比较，敏感度和特异性度均为100.0%。

　　1.2.2、 环介导等温扩增技术

　　环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP）由日本科学家Notomi[21]等在2000年发表于Nucleic Acids Research杂志上。该技术一经面世便因其对设备要求低、反应迅速、灵敏度高等优点，得到世卫组织WHO和各国学者的关注，并在此基础上不断研究优化应用于生物学、医学和农学等各个领域。姜侃[22]等针对肠球菌16S r RNA中高度保守的序列分析设计特异性引物建立乳品中肠球菌的LAMP快递检测方法。结果表明，该方法可在14h内完成检测，灵敏度达到10fg/μL，比常规PCR高3个数量级。对164批次婴幼儿奶粉进行检测，检出率为22.6%，与行业标准检测方法结果一致。

　　1.2.3 、多位点基因序列分析（MLST)

　　多位点序列分析（Multilocus Sequence Typing,MLST）是采用多个保守基因位点对菌种进行鉴定分型的方法。通过公共数据库（www.mlst.net）对全球范围内的数据进行比较分析。应用于肠球菌研究的MSLT主要集中在屎肠球菌和粪肠球菌[14]。该方法各针对两种菌的7个管家基因设计引物，对其进行PCR扩增和测序，得出各个基因位点的等位基因数值，分析序列和等位基因图谱，在此基础进行系统聚类分析。杨晶[23]等对四川省自贡市肉及其制品中粪肠球菌进行耐药性毒力基因和多位点序列分型分析，结果指出，相同的ST型别的粪肠球菌有相似的耐药谱图和毒力基因携带情况。

　　2、 肠球菌药物敏感性实验方法比较研究

　　肠球菌药敏试验方法在实际操作中按结果主要分为测量药物纸片抑菌圈直径大小的K-B纸片琼脂扩散法；检测最小抑菌浓度（MIC）的微量肉汤稀释法、琼脂稀释法及自动化药敏检测法；以及扩散法和稀释法相结合的E-test实验。

　　2.1、 K-B纸片琼脂扩散法

　　K-B纸片琼脂扩散法是目前应用较广的一种药敏实验方法。该方法通过将浸有各类药物的纸片贴在均匀涂布0.5麦氏浓度菌液的M-H琼脂平板上，经过24h培养后，测量抑菌圈的大小，对照判定标准快速判读结果。抑菌圈的直径与MIC值呈负相关。目前实际操作中，K-B法采用的是美国临床和实验室标准化委员会（CLSI）推荐的标准。杨龙斌[24]等对江淮地区40株猪源肠球菌进行K-B法药敏测试发现，40株肠球菌均耐以上6种药物，耐以上8种药物的占95%，提示江淮地区猪源肠球菌多重耐药现象很严重。K-B法所要求的试验条件相对较低，可广泛应用于实际，但近期有报道[25]指出，在肠球菌检测万古霉素时，K-B法测定结果与稀释法和仪器法存在显着差异，结果证明，在万古霉素药敏测定中K-B法并不可靠。另外K-B法的结果受限于培养时间、接种菌量、药敏纸片的质量、琼脂厚度等因素，并不适合作为药敏判定结果的最终指标，更适合未知耐药菌株的初步筛查。

　　2.2、 微量肉汤稀释法、琼脂稀释法及自动化药敏检测方法

　　微量肉汤稀释法能有效测定出菌株的最小抑菌浓度，操作步骤标准化，商品化的药敏板也已经开始在实际检测中应用，是农业农村部动物源耐药性监测工作的指定方法。琼脂稀释法与微量肉汤稀释法在实验原理上均为测试菌株的最小抑菌浓度，不同在于琼脂稀释法介质为固体琼脂平板。琼脂稀释法通过将菌液点种在含有不同浓度药物的琼脂平板上，经培养后观察其生长情况，以细菌不能生长的药物浓度为MIC值。琼脂稀释法同样能精确的测定MIC值，重复性好，能同时测定大量菌株，还能观察被测菌株是否染有杂菌[26]，但当样品量小时，其操作过于繁琐，耗时过长，实验试剂浪费过多。除了上述两种手工操作方法外，目前市面上自动化的药敏检测仪器包括VITEK、Micro Scan、ATB等系统。李萌[25]等利用VITEK32细菌自动分析仪GPS-TB药敏卡检测肠球菌对万古霉素MIC时，与肉汤稀释法相比较，实验证明两者没有显着差异，对万古霉素的药敏结果可靠。自动化药敏系统的优点在于高效、准确、操作简便，但缺点在于成本较高，药物种类受限较多。

　　2.3 、E-test实验

　　E-test实验是结合K-B法和琼脂稀释法的一种新的药敏测试方法。该方法操作同K-B纸片扩散法，简便易操作，又利用预制的含有一系列药物浓度的E-test条，得到该药物的最低抑菌浓度（MIC）值，具备稀释法同样的效果，且可选择药物种类多，在近年实验室应用中越来越普遍。在E-test实验中，所采用的E-test试纸条是实验结果准确度最关键的耗材。刘亚丽[27]等比较了5种国产试纸条（青霉素、氯霉素、万古霉素、两性霉素B和氟康唑）和法国梅里埃进口试纸条的药敏判定结果，两者一致性较好，均准确可靠，国产试纸条在降低检测成本的同时，可以提供准确的结果。

　　3、 肠球菌耐药机制的研究

　　肠球菌对抗生素的耐药性可以分为天然性耐药和获得性耐药。肠球菌的天然耐药性由染色体基因决定的。肠球菌的细胞壁坚厚，对很多现有的抗生素有天然的耐药性，如头孢类抗生素、氨基糖苷类抗生素、克林霉素等。肠球菌的获得性耐药是肠球菌通过质粒、转座子、整合子-基因盒系统等方式从其他细菌得到耐药基因，从而使肠球菌产生耐药性，如高水平的β-内酰胺类、万古霉素、四环素等。

　　3.1、 β-内酰胺类耐药

　　β-内酰胺类抗生素的作用机理是通过抑制青霉素结合蛋白，阻碍细胞壁的合成，从而杀死细菌。20世纪80年代早期发现了β-内酰胺类耐药的肠球菌，研究其耐药原因，主要是因为其能产生β-内酰胺酶。肠球菌的β-内酰胺酶由tem基因编码，其耐药机制是低亲和力的青霉素结合蛋白的过度产生及此蛋白对青霉素结合力的减弱[28]。王蒙蒙[29]等报道，我国新疆北疆地区的49株猪源粪肠球菌中tem基因的检出率最高，为93.88%。顾欣[30]等报道，上海地区的133株粪肠球菌中tem基因的检出率为63.2%，在耐药表型阳性的菌株中的tem基因检出率为85.7%，基因型阳性的菌株耐药表型均为阳性，结果表明，携带tem基因是导致粪肠球菌耐药的主要原因。

　　3.2、 大环内酯类耐药

　　肠球菌对大环内酯类药物的耐药基因主要包括介导药物靶位改变的红霉素核糖体甲基化酶基因（Erm基因）、介导抗生素主动排外的mef A基因和msr基因等。Erm基因通过对细菌23s RNA转录后的修饰作用，影响了23s RNA与药物结合的空间结构，从而减少药物的结合，产生耐药性[31]。已发现的erm基因有20余种，肠球菌中的Erm基因主要是Erm B。mef A基因和以ATP为动力的msr基因都是抗生素主动排外基因。该类基因通过编码转运蛋白，将抗生素泵出菌体外，使细胞内的抗生素浓度降低，从而产生耐药性。王伟军[32]等对临床分离的72株粪肠球菌进行耐大环内酯类药物耐药基因（Erm B、Erm TR、mef A和mef E）检测，发现57株（79.1%）检出Erm B基因，54株耐红霉素的菌株中Erm B基因的携带率为96.4%，未检出其他3种耐药基因。顾欣[30]等检测上海地区的133株粪肠球菌，其中132株耐红霉素，Erm B的检出率为95.5%，未检出mef A基因，在耐药表型阳性的菌株中Erm B基因检出率为96.2%，基因型阳性的菌株耐药表型均为阳性，结果表明，Erm B基因是导致红霉素耐药的主要原因，mef A基因的主动排外机制未发现。关于粪肠球菌耐药的主动排外机制有待进一步研究。

　　3.3、 四环素类耐药

　　肠球菌获得四环素耐药除了极少出现的自身染色体突变导致的以外，主要是获得外源耐药基因导致。外源基因作用机制主要分为核糖体保护机制，如tet M基因和抗生素主动外泵机制，如tet L基因。已发现的四环素耐药基因有近50种，包括核糖体保护蛋白基因12种、外排泵基因30种等[33]。目前肠球菌耐药基因研究文献报道中最多的是核糖体保护蛋白基因tet M，其编码的核糖体保护蛋白，使得肠球菌对四环素类药物产生抗性。王蒙蒙[29]等报道，我国新疆北疆地区的49株猪源粪肠球菌中tet M基因检出率仅次于tem基因，达到85.71%。顾欣[30]等报道在上海地区分离的133株粪肠球菌中耐红霉素的为129株，tet M基因检出率为91.0%，基因阳性与表型阳性符合率在93.8%。王铃飞[34]等对14株屎肠球菌进行四环素耐药基因检测，分别有13株tet L和9株tet M，其中9株同时携带tet M和tet L，提示猪屎肠球菌的耐药性主要与这两种耐药基因有关。

　　3.4、 氨基糖苷类药物

　　肠球菌对低浓度的氨基糖苷类药物具有天然耐药性。美国临床实验室标准化委员会（NCCLS)建议将肠球菌在氨基糖苷类药物上的耐药程度分为中度耐药和高度耐药。目前已知的有高水平庆大霉素耐药、高水平链霉素耐药等[35]。肠球菌高水平氨基糖苷类耐药主要是其获得编码氨基糖苷类修饰酶的基因所导致的。氨基糖苷类修饰酶目前已知有30多种，其中最常见的4种包括由aac (6′)/aph (2")基因编码的能使青霉素或糖肽类药物与氨基糖苷类药物协同作用消失的6′位-乙酰转移酶/2"位-磷酸转移酶AAC (6′)/APH (2")双功能酶；由aph (3")-Ⅲ编码的3′位-磷酸转移酶APH (3′)-Ⅲ；有ant (6)-Ⅰ编码的6位-核苷转移酶ANT (6)-Ⅰ；由ant (2")-Ⅰ编码的2"位-核苷转移酶ANT (2")-Ⅰ。贾伟[36]等研究表明，在高水平氨基糖苷类耐药的粪肠和屎肠球菌中aac (6′)/aph (2")的阳性率分别为88.5%和52.4%，检出率占比最高。齐亚银[37]等在动物源（牛、羊、猪、鸡）粪肠球菌的耐药基因检测中发现，aac (6′)/aph (2")检出率达到55%,ant (6)-Ⅰ检出率大道55%,aph (3")-Ⅲ检出率达到25%，与耐庆大霉素表型60%的检出率基本一致。

　　4 、小结

　　自第一种抗生素发现以来，人类对抗生素的应用在不断加大、加深，其应用范围不只局限在治疗人类疾病，更多地应用在养殖业上。除了用于治疗食品动物的疾病外，更多的是添加到饲料中起到预防疾病和促生长作用。据报道，2010年我国食品动物中抗生素的使用比例已到全球的23%，位列第一，远超第二的美国[8]。在抗生素用量逐年增加，细菌耐药性问题已成为不可避免的难题，特别是有研究表明，动物源的耐药菌和耐药基因可沿“养殖动物-环境-食品-人群”链条传播[38]，使得细菌耐药性的研究不仅是医学问题。肠球菌作为一种人畜共患的条件致病菌，由于其基因的可塑性强，成为耐药基因的存储库，对其耐药性发展的研究成为热点。汪玲[39]等对人源和动物源性肠球菌Erm B基因进行研究，试验表明，Erm B基因在体外条件下可在人源和动物源肠球菌之间传递。另外，人源和动物源肠球菌及不同种属的肠球菌有相同的Erm B等位基因，提示其耐药基因在动物源和人源水平传播存在可能性。

　　基于目前的研究成果反映的现状，为了遏制动物源细菌耐药性的进一步发展，我国农业农村部出台了各项政策，包括《遏制细菌耐药国家行动计划（2016-2020年）》《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017-2020年）》等，采取了限制促生长类抗生素的使用，建立全国范围动物源细菌耐药监测体系等措施。未来随着各种检测技术，特别是分子生物学的发展，对动物源肠球菌耐药性的研究，及其人畜之间传播的可能性研究更为值得关注。

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