血 管 平 滑 肌 细 胞（vascular smooth musclecells,VSMCs）是动脉发生钙化的主要细胞，最近研究发现血管钙化类似于骨的形成，它是由细胞介导的主动调节过程，同时存在平滑肌细胞表型转变，并与多个成骨相关类因子相关[1].以往体外研究动脉病变的平滑肌细胞主要来自动物或人的主动脉[2],而对外周动脉的研究很少。血管平滑肌细胞是血管中膜的主要细胞成份，它的钙化与血管的许多生物学行为有关。既往报道[3],VSMCs体外培养后传代，其生物学特性仍然接近体内细胞，以体外培养VSMCs为基础。模拟各种体内外干预条件，观察研究VSMCs的细胞及分子生物学特性的改变，是研究心血管疾病发病机制的良好手段。本研究以酶消化法为基础，总结一种方便、快捷、重复性高的分离、培养方法并进一步建立体外平滑肌细胞钙化诱导模型，为外周动脉病变体外研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
DMEM培 养基（Hyclone公 司）、胎牛 血 清（Hyclone公 司）、DAPI染 液（Sigma公 司）、DMSO,0.25%胰蛋白酶（上海碧云天公司）、一抗：α-SMA单克隆抗体（Bioworld公司）、二抗：羊抗兔FITC标记二抗（武汉博士德公司）、山羊封闭血清（北京博奥森公司）。
1.2人股动脉VSMCs的体外培养
1.2.1人股动脉分离及原代培养
取正常人股动脉，由中山大学附属医院血管外科王冕博士提供，取自于正常遗体捐献者。无菌环境下手术刀片刮除外膜和内膜，将中膜平滑肌层分别剪成1~2mm大小的组织块，镊子逐个贴在25cm2培养瓶上，培养瓶缓慢翻转，加入20%的胎牛 血清含100U/L的青 链霉素的DMEM培 养 液10ml,孵育在37℃，5%的CO2的培养箱中；2h后轻轻翻转培养瓶，组织块被充分覆盖。培养箱中孵育，2周左右观察平滑肌细胞生长情况。
1.2.2人股动脉平滑肌细胞的传代培养
将相互融合的原代培养的人股动脉VSMCs,在换液后的d3,弃去原培养液，用无菌的PBS轻轻冲洗3遍，用胰酶消化1min后，随即加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用吸管反复吹打培养瓶100次，注意用力不能太大，否则细胞破碎。使细胞完全脱离瓶壁，镜下计数：调整密度为1.0×105/ ml的细胞悬液，吸取5ml传入新的培养瓶中，每3d换液1次，每次换液量约4ml,待细胞长至融合状态后，可再传代。
1.3人股动脉平滑肌细胞的鉴定
1.3.1细胞形态学观察
将培养的平滑肌细胞置于倒置显微镜下，观察细胞贴壁、生长状况及形态并照相。
1.3.2免疫荧光染色
（1）将平滑肌细胞接种在13mm直 径圆形载长约40%~50%左右，吸取培养基，加PBS冲洗3次，每次5min左右；（2）加入4%的多聚甲醛4℃条件下固定15min,加入PBS冲洗5min×3次，之后用预冷CH3OH洗3次；（3）预冷CH3OH -20℃通透平滑肌细胞5min,PBS再次冲洗5min×3次；（4）用10%的 山羊血清5%BSA封 闭液室温封闭20min,加入1:150小鼠抗人平滑肌α-actin单克隆一抗，4℃孵育过夜，次日室温复温1h;（5）加入PBS清洗5min×3次，滴加绿色荧光标记的羊抗小鼠二抗，室温避光孵育1h,PBS清洗5min×3次；（6）DAPI染 液 染细胞核15min,dd H2O清 洗； （7）Mounting Medium封片，荧光显微镜拍照，4℃避光保存。
1.4冻存细胞
选融合度>90%的细胞；按传代方法用EDTA把贴壁生长的细胞消化下来，反复吹打100次；1000rpm离心去上清，吸入离心管中。先用DMEM高糖培养基8份+1份胎牛血清+1份二甲基亚砜配成10%的细胞冻存液，混匀后吸管吸至10ml离心管中，然后吹打细胞，动作轻柔，使细胞充分混匀。分装至1.5ml冻存管中。将细胞冻存管放入4℃冰箱30min,后置入-20℃冰箱2h后，直接放入-80℃冰柜中。
1.5钙化模型的建立
用钙化培养基（正常对照组的DMEM培养基中 加 入10mmol / L β磷 酸 甘 油，10mmol / L丙 酮酸）培养，2d换液1次，连续培养10d,以制备钙化的VSMCs.
1.6统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件分析，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。
2 结果
2.1原代平滑肌细胞培养（图1,见插二）
组织块贴壁后1周，在倒置显微镜下观察，发现有细胞从垂直方向从组织块边缘迁移萌出（图1A）；2周 左右当组织块中大部分细胞萌出后，组织块便脱离，其周围细胞密度更加增大，部分区域细胞相互接触交替生长，出现“峰-谷”结构（图1B）。平滑肌细胞从组织块的周围爬出，随着时间的推移，4周时，平滑肌细胞呈典型的“峰谷状”生长（峰：即多层细胞丘，可达8~10层，谷：即稀疏排列的单层细胞处，甚至无细胞处）（图1C）。
随着传代次数的增多，平滑肌细胞生长周期逐渐缩短，五代以后维持在3~5d左右，八代以后维持在1~2d左右，所以我们选用3~8代的细胞作为本实验的细胞。
2.2平滑肌细胞的鉴定
如图2（见封三）示，经过免疫荧光发现，细胞SMα-actin高表达，说明成功培养出平滑肌细胞。
2.3平滑肌细胞钙化模型的建立及鉴定
2.3.1钙化斑块的形成（图3,见封三）
正常培养见图3上，钙化培养见图3下。在普通培养基下，几乎不可见钙化斑块形成（白色光点为钙化斑块）；而在钙培养条件下，可见平滑肌细胞出现明显的钙化斑块。
2.3.2 VON KOSSA染色（图4,见封三）
正常对照见图4上，钙化培养见图4下。在普通培养基下，几乎看不到钙化斑块形成（细胞VON KOSSA染 色，核固红复染后若为钙沉积则细胞质，细胞核均呈现红色或者淡粉色）；在钙化培养条件下，可见平滑肌细胞出现明显钙化斑块。
2.3.3 VON KOSSA后光密度值比较
通过软件分析钙化斑块的累积光密度值，发现钙化组钙盐沉积量显着高于对照组（0.24 vs.0.04,P<0.01）。
3 讨论
血管平滑肌细胞（VSMCs）是血管发生钙化的主要细胞，它的异常增殖是高血压、冠状动脉粥样硬化和冠状动脉介入治疗（PCI）术后再狭窄（RS）等疾病的主要病理生理机制[4].对 于高钙导致血管钙化的机制尚未明确，目前采用的措施及方法比较局限[5].既往的研究只局限于动物和主动脉，和外周动脉存在很大的生物学差异，不能反映人体外周血管病变的细胞学特点。所以我们选用成人股动脉平滑肌细胞来作为研究的对象。目前众多实验室仍采用培养猪、兔、鼠等动物血管平滑肌细胞来研究平滑肌细胞的表达，但动物与人比较，有很大生物学特性的差异，亦有研究者采用胸主动脉、肠系膜动脉、人脐动脉来进行体外试验，但是取材困难，亦不能代表外周血管平滑肌细胞所具有的特点。所以本实验选择采用更接近于外周血管特点的人股动脉，通过改良的方法，使用组织块贴壁法来建立人股动脉平滑肌细胞体外培养模型，为完成相关的实验打好坚实的基础。
通过组织块贴壁后3周，在倒置显微镜下观察，发现有平滑肌细胞从组织块周围爬出，随着时间的推移，5周时平滑肌细胞呈典型的“峰-谷”生长，随着传代次数的增多，平滑肌细胞生长周期逐渐缩短，五代以后维持在3~5d,八代以后维持在1~2d,所以我们选用3~8代的细胞作为本实验的细胞。通过免疫荧光发现，细胞SMα-actin高表达，说明成功培养出平滑肌细胞。
VSMCs体外诱导钙化是研究心血管疾病发病机制的重要细胞模型。 Giachelli首先证实了人VSMCs在高钙、高磷培养基中生长可发生钙化[5].β-磷酸甘油是碱性磷酸酶的作用底物，分解后可以产生磷酸盐，供给体外钙化所必需的磷离子，从而促进细胞钙沉积[6,7].而平滑肌细胞的钙化是导致ASO发病和外科干预再狭窄的主要原因[8,9].我们研究发现平滑肌细胞经钙化培养10d后，钙化组与正常组别相比，在普通培养基下，几乎无钙化斑块形成（白色光点为钙化斑块）；而在钙培养条件下，可见平滑肌细胞内出现明显的钙化斑块及钙盐沉积。通过平滑肌细胞VON KOSSA染色结果表明对照组细胞质、细胞核均未呈现红色，而钙化组细胞质、细胞核呈现粉红色。累计光密度值分析后发现，钙化培养10d后，细胞内钙盐沉积量显着高于对照组。
本研究证实了人股动脉平滑肌细胞处于高钙环境下钙化的表达，这与体内血管钙化形式非常接近，可作为研究外周血管钙化的细胞模型。
4 参考文献
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