细胞培养中的微生物污染及防控对策

　　

        细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。体外细胞污染可分为3类： 物理性、化学性、生物性污染[1].其中生物性污染常见且造成的后果也较为严重，培养的细胞一旦遭到微生物污染，将具有不可逆转性，轻则污染细胞废弃，重则连带污染培养箱内的其他细胞，甚至整个实验室的环境，给科研工作带来严重的损失和威胁。以下对细胞培养过程中常见的微生物污染及防控作以介绍。
　　
　　1 细菌污染
　　
　　细菌污染特点为污染速度快，易被发现。细菌污染后，培养基1 ~ 2 d就会变浑浊，对细胞生长影响明显[2],p H值改变[3].常见细菌种类为大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌等（ 革兰阴性菌） 葡萄球菌等（ 革兰阳性菌）[4-5],其中革兰阳性菌较为多见[6],利用此特点可指导抗生素的应用。污染主要来源实验室环境、实验人员（ 实验服）、实验用具等[4].污染后的镜下特点为： 胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从壁上脱落，污染较轻时可见小菌体在细胞间运动[5].
　　
　　疑细菌污染后，可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类； 有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物 的 培 养 液 接 种，也 可 取10 m L细 胞 悬 液 以100 rpm离心5 min,沉淀中加入无抗生素的培养液2 m L,置于37 ℃培养，24 h可得结果。确定污染后，若想进行挽救可在细菌污染培养液中添加双抗（ 青链霉素）、西司他丁钠+亚胺培南消除细菌污染[4,7].
　　
　　2 霉菌污染
　　
　　霉菌污染特点为短期内不会引起培养液的浑浊，可在培养液中形成白色或黄色漂浮物。污染的主要来源为实验人员（ 实验服）[5].污染后的镜下特点为： 低倍镜下可见乳白色的团状漂浮物，培养液无变化； 高倍镜下可见明显的菌丝，细胞活力变差，生长速度明显变慢，甚至死亡[8].
　　
　　疑有霉菌污染的细胞可离心后经PAS染色进行霉菌镜检，同时进行霉菌培养以确定污染及鉴定霉菌种类[9].霉菌污染初期，在培养液中可见漂浮的菌丝，这时将污染的细胞培养液慢慢吸出，用Hanks液清洗细胞及瓶壁2 ~ 3次，加入含有以下抗生素的培养液，即青霉素100单位/m L,链霉素100单位/m L,两性霉素10 mg /L,24 h后观察换液，若仍有菌丝可重复上述步骤进行处理，2 ~ 3次后就基本得到控制[8].但经此种方式处理后对细胞的生长影响也较大。另有报道低速离心法可清除霉菌污染，方式简单对细胞影响小[9].但建议一般出现霉菌污染，如果不是非常珍贵的细胞一般都是扔掉，而且连相关的容器都要做严格的处理。
　　
　　3 支原体污染
　　
　　支原体污染的特点为短期无变化，具有隐蔽性。它们可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常的感觉。如果继续使用这种已被支原体污染而貌似正常的细胞做试验或生产，将会严重影响结果[1].污染的主要来源为血清[4].污染后镜下特点： 在光镜下常可见到细胞核及胞浆内出现大小不等的颗粒或空泡[10].
　　
　　目前实验室检查支原体污染的金标准为DNA荧光染色法结合直接培养法[11],主要辅助检测方法有PCR法、显 微镜法等[12-16],其他方法有滚环扩增技术[17]、瓜氨酸测定法[18]、免疫荧光抗体法、放射自显影法[19]等。相对于其他污染的检测，支原体污染的检测方法虽多，但在价格及特异性方面差异很大，应根据实验需要及实验条件进行选择。支原体的清除一般不宜用抗生素，因其对抗生素不敏感，主要的清除方法有抗血清处理法、高温处理法、小鼠腹腔巨噬细胞清除法、选择性杀灭哺乳动物类细胞培养物中支原体的方法，其中小鼠腹腔巨噬细胞清除法效果较好，方法是将支原体污染的细胞注射到小鼠腹腔。经24 h或48 h后，将小鼠腹水抽出（ 腹水已含注入的细胞） ,经离心后收集细胞于培养瓶内培养[19].因在日常细胞培养过程中支原体的污染常被忽视，为了避免损失可 定 期 对 实 验 室 中 的 培 养 物 进 行 支 原 体 检测[20].