病毒组织细胞培养方法及注意事项探究

　　细胞培养论文（专业范文8篇）之第八篇

　　摘要：细胞培养是病毒学实验研究必不可少的重要工具和手段。本文以猪乙型脑炎病毒在猪肾上皮细胞 (PK-15细胞) 增殖培养为例, 介绍一下病毒的细胞培养方法, 和一些注意事项。

　　关键词：细胞培养,PK-15细胞

　　随着畜牧业的高速发展, 养殖规模的不断扩大, 动物疫病也成为困扰广大养殖户的首要问题。检测出明确的疫病类型, 是做好养殖业防控治疗的关键。对发病毒株的更深一步的研究, 可有助于研制适于当前流行疫病的疫苗和药物制剂。这样, 病毒前期的分离培养就尤为重要, 因为病毒缺乏完整的酶系统, 又无核糖体等细胞器, 所以不能在任何无生命的培养液内生长。试验动物、鸡胚以及体外培养的组织细胞就成为人工增殖的基本工具。细胞培养与实验动物和鸡胚相比, 不仅经济、方便、省时、省力, 而且能提供大量生物性稳定的细胞群体, 降低了外界因素的影响, 使实验结果更加准确可靠。

　　1 病毒组织细胞培养方法

　　1.1 细胞培养所需仪器设备

　　干燥箱、恒温培养箱、普通冰箱、-80 ℃低温冰柜、高压消毒器、恒温水浴箱、普通离心机、真空泵、蔡氏滤器、显微镜、无菌室、超净工作台、细胞培养瓶、移液管 (1 m L、5 m L、10 m L) 等。

　　1 . 2 病毒培养过程所需溶液的配制

　　1.2.1 营养液的配制营养液是组织细胞中赖以生长和增殖的直接环境, 不仅要求含有多种营养物质, 而且必须保证适宜酸碱度、温度、渗透压和气相等。以配制10 m L营养液为例:需灭菌蒸馏水7.8 m L、EME0.9 m L、双抗 (青霉素和链霉素) 0.2 m L、犊牛血清1 m L、Na 0.1 m L, 调p H值7.2-7.4。

　　1.1.2 维持液配制 (以10 m L为例) 需灭菌蒸馏水8.3 m L、MEM0.9 m L、双抗 (青霉素和链霉素) 0.2 m L、犊牛血清0.5 m L、Na0.1 m L调p H值7.2-7.4。

　　1.1.3消化液配制 (以10 m L为例) 灭菌蒸馏水9 m L、胰酶1 m L。

　　1.2 PK-15细胞复苏

　　从液氮罐中取出冻存的PK-15 细胞 (约1.8 m L) 迅速放入40 ℃水浴锅中 (大约2 min) 使其溶解, 然后放入离心机中1 000 rpm, 离心5 min, 弃冻存液, 用1 m L吸管, 吸培养液使细胞重新悬浮, 吹打细胞, 全部移入培养瓶, 放37 ℃ CO2培养箱培养24 h, 显微镜观察结果:细胞都贴壁生长, 均匀平铺在瓶壁上, 形状整齐、轮廓清晰, 在无菌操作台, 把细胞培养瓶中的营养液倒掉, 换维持液, 培养24 h, 把原培养瓶中的维持液倒掉, 把消化液分三次加入细胞培养瓶中, 每次从细胞贴壁的一面开始消化 (轻摇) , 四面都洗完, 把消化液倒掉, 把培养液加入培养瓶, 分装成两瓶。继续按上述步骤进行细胞传代培养。

　　1.3 猪乙型脑炎病毒接种传代好的PK-15 细胞

　　取处理好的病毒组织, 12 000 rpm离心10 min, 取上清接种于倒掉培养液的细胞培养瓶中, 37 ℃感作1 h (每隔15 min慢慢摇动一次, 使病毒与细胞充分作用) ;同时做空白对照。1 h后, 把接毒瓶与对照瓶同时加维持液 (维持液调p H 7.6) , 放37 ℃温箱, 解毒12 h后, 接毒细胞无明显变化, 相对于对照细胞, 维持液稍黄, 16 h后, 维持液开始变浑浊, 接毒20 h后细胞有了明显变化, 细胞界限模糊不清晰, 细胞的生长受到抑制, 有些细胞有融合现象, 已有两个或三个细胞融合为一个细胞 (这时, 要在接毒细胞和对照细胞中均加入2 m L Na HCO3, 调环境p H7.5-7.7, 要使维持液保持一定的p H环境) , 接毒24 h后, 接毒细胞形状变细长, 36 h后90%细胞已经圆缩, 开始收毒, 收的乙脑细胞毒放-80 ℃低温冰柜冻36 h, 然后拿出冻融一次 (-80 ℃病毒放4 ℃冰箱2 min, 然后融化再放入-80 ℃冰柜) , 3 h后, 取出病毒按上步骤融化分装, 为第一代病毒。取第一代病毒接种细胞, 按以上操作步骤进行传代。传代到十代以上, 可以保存病毒作为下一步试验用毒。

　　2 病毒组织细胞培养注意事项

　　1) 培养液配制时, 采用的动物血清是细胞生长所必须的营养物质, 有很强的酸碱缓冲作用和促进细胞贴壁的作用。一般采用犊牛血清, 但不是所有病毒都通用一种血清, 比如犊牛血清就抑制细小病毒的生长, 要改为5月龄以内的胎牛血清。所以, 根据所增殖病毒的不同, 加入其适宜的血清。营养液的p H值, 细胞最适生长的p H范围是7.0-7.4, 细胞通常可耐受p H 6.6-7.8 较大范围的变化, 偏酸或偏碱的环境持续时间不宜超过24 h, 否则细胞很快老化。较碱的生长液更适于细胞贴壁, 但培养时的p H应保持在7.2-7.4 之间。

　　2) 培养细胞所用培养瓶, 移液管等玻璃器皿洁净与否, 对于细胞培养十分重要。必须经清水冲洗, 再于1%优质洗衣粉的水溶液内蒸煮30 min, 随后刷洗, 并用清水和蒸馏水分别冲洗5~6次以上, 烘干。然后经包扎于160~170 ℃ 干燥灭菌2 h, 取出备用。

　　3) 细胞培养和接毒后培养的内外环境一定要保持无菌, 工作前后要紫外灯半小时杀菌, 尤其是环境中不要感染支原体, 否则, 细胞培养将无法继续。

　　4) 一般细胞培养到5 代以后, 可以进行接毒。病毒传代到13 代以后基本稳定, 可以作为下一步试验用毒。一般在接毒培养瓶内约有2/3 的细胞发生折光性增强、凝缩不整及细胞核变形、破碎、脱落时, 应立即收获。在实际工作中, 往往因病料中病毒含量少或病毒起初不适应在细胞内增殖, 初代分离病变不明显, 但通过盲传而逐步增强, 从而达到分离病毒的目的。

　　5) 不同的病毒, 会有自己所敏感的增殖细胞。因此, 实际工作中, 我们要根据自己所研究的病毒, 选择适宜的培养细胞。病毒传到多少代可以达到稳定状态, 不同的病毒也会不同, 要根据具体试验结果而定。