低强度脉冲场超声对充质干细胞的增殖作用研究

　　【摘要】 目的 运用低强度脉冲场超声（LIPUS）刺激促进人脂肪间充质干细胞（hASCs）增殖，为临床干细胞体外高效增殖提供新方法。方法 通过LIPUS体外刺激hASCs细胞生长，采用Scepter 2.0手持细胞计数器进行细胞计数，运用荧光倒置显微镜观察细胞形态，运用流式细胞仪检测细胞表面标志物，并进行干细胞临床前质量检测。结果 刺激组50 mW/cm2和60 mW/cm2的LIPUS刺激强度均能促进细胞增殖，60 mW/cm2强度更显着，与对照组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；细胞倍增时间比对照组缩短，差异具有统计学意义（P<0.05），刺激后刺激组细胞表面标志物无变化，增殖后干细胞质量检测符合标准要求。结论 LIPUS刺激可促进hASCs有效增殖，低强度脉冲场超声可作为干细胞体外扩增的新方法。
　　
　　【关键词】 低强度脉冲场超声；人脂肪间充质干细胞；细胞增殖；质量检测。
　　
　　低强度脉冲场超声（low-intensity pulsed ultra-sound,LIPUS）作为高频、小振幅和脉冲压力波传递机械刺激经皮进入生物组织的一种非侵入性的治疗方式[1]
,目前被广泛应用于临床治疗。有报道，LIPUS刺激既促进细胞DNA和蛋白质合成[2],又促进细胞对钙的吸收[3].LIPUS亦可提高细胞活性、细胞因子释放、基因表达、矿化率、Akt 信号、钾流动、血管生成、腺苷酸环化酶活性和TGF-β合成的影响等[4-6],对再生医学具有重要意义。
　　
　　脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived mesen-chymal stem cells,ASCs）由于其来源广、且容易获得等特点，已经成为新一代组织工程种子细胞的来源之一。随着近年来干细胞研究领域的快速发展，人们对干细胞生物学的了解越来越深入。人脂肪间充质干细胞（hASCs）因具有低的免疫原性和强大的免疫调节特性，被用于同种异体的细胞移植等，治疗多种疾病和组织损伤[7-8],促进了干细胞移植和再生医学的发展。
　　
　　LIPUS促进体内组织的修复，那么它应先促进体内细胞增殖然后再作用于损伤部位。然而，以往的研究者未见运用LIPUS对hASCs细胞增殖的研究，且促进细胞增殖机制未明确。本实验中，我们运用LIPUS刺激促进hASCs增殖，增殖后干细胞质量检验符合要求，实验结果为hASCs体外高效扩增和产业化提供依据。
　　
　　1 材料与方法

      1.1 材料

      1.1.1 细胞来源
      人脂肪间充质干细胞购自广州赛业生物科技有限公司，按标准操作进行培养和传代[9-11].
　　
　　1.1.2 仪器和试剂
     人脂肪间充质干细胞完全培养基（广州赛业生物科技有限公司）；0.25%胰酶消化液（Gibco 公司）；流式抗体 CD105-PE、CD73-PE、CD34-PE、CD14-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE和HLA-ABC-PE （广州BD 公司）；支原体培养和鉴定药敏检测试剂盒（中山市天祥电子生物传感器有限公司）；实时定量PCR法检试剂盒（中山达安基因检测有限公司）；细菌内毒素检查试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂有限公司）；快速革兰氏染色试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司）；细胞培养皿、12孔板、50 mL离心管（Grenier公司）；手持细胞计数仪（Merck Millipore 公司）；细胞扩增仪 SonaCell（加拿大 Intelligent-Nano 公司）；细胞培养箱（美国 Ther-mo）；实时定量 PCR 仪（瑞士罗氏公司）；荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）。
　　
　　1.2 方法

      1.2.1 SonaCell
      细胞扩增仪 LIPUS 刺激 Sona-Cell （Jie Chen 提供）超声设备是基于生物学和临床研究的基础上设置的：超声频率为1.5 MHz,脉冲重复频率为1 kHz,脉冲循环为20%.超声平均强度可调整在0~100 mW/cm2.仪器探头通过耦合剂紧贴培养皿底部进行辐照，本实验选用SonaCell细胞扩增仪40 mW/cm2、50 mW/cm2、60 mW/cm2强度的LIPUS刺激[12]为刺激组，0 mW/cm2强度为对照组。取hASCs第3代细胞2×104个的密度1 mL接种于12孔板相应的孔中，细胞培养24 h后换液，然后使用SonaCell设备的LIPUS刺激部件于细胞培养箱中刺激，5 min/d,连续刺激4d （即细胞培养24 h、48 h、72 h、96 h），第5天收集细胞并计数。细胞倍增时间（population doubling time,PDT）计算方法：t=T/3.32 （lgN2-lgN1），T为对数期的持续增长时间，N1和N2分别是对数增长开始和结束的细胞数量。做5组重复实验，对数据进行统计学分析。
　　
　　1.2.2 细胞计数
      运用 Scepter 2.0 手持细胞计数器进行细胞计数，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化并收集细胞，用适量的D-PBS重悬细胞，取150 ?L细胞悬液至1.5 mL离心管中，使用Scepter 2.0计数器的60 ?L感应探头插入液面以下。根据制造商的说明书进行操作。使用Scepter Software Pro软件进行数据分析，准确测量细胞的直径和每毫升体积内细胞的数量。
　　
　　1.2.3 细胞形态观察
      由于细胞生长至第 5 天（120 h）后，显微镜下观察不好分辨细胞的数量。本实验选择第2次刺激后12 h （即细胞培养60 h），对数生长期初始阶段，将刺激组和对照组细胞置于倒置显微镜下观察，运用Image-Pro Plus软件拍照。
　　
　　1.2.4 hASCs
      免疫表型测定 通过流式细胞仪测定hASCs 刺激组与对照组表面标记物CD105、CD73、CD34、CD14、CD45、HLA-DR 和 HLA-ABC 的表达情况。取消化待测细胞，用D-PBS缓冲液清洗两次。调整细胞浓度为3×105个/mL,加入适量荧光标记的单克隆抗体，室温，避光孵育30 min.再清洗一次，重悬，上机检测，运用BD FACSDIVA软件进行分析。
　　
　　1.2.5 取第 3 代刺激后 hASCs 进行无菌试验、支原体检测、内毒素检测、革兰氏染色、人源特定病毒检测
      参照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》和《中华人民共和国药典》2010 年版三部附录进行[13-14].
　　
　　1.3 统计学方法
      应用 SPSS20.0 统计学软件包进行数据分析，采用GraphPad Prism6 软件作图。首先对数据行正态性检验，若不符合正态分布，通过正态性转换后再下一步处理。组内比较采用One-wayANOVA 检验方法，组间比较采用独立样本 t 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结 果

      2.1 LIPUS 刺激促进 hASCs 体外增殖 LIPUS刺激 hASCs 体外增殖，第 5 天计数结果显示刺激组50 mW/cm2和60 mW/cm2强度都有促进细胞增殖的效果，其中60 mW/cm2刺激强度最明显，细胞倍增时间较对照组缩短，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1和图2.