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尼古丁及其受体阻断剂对人胚皮肤成纤维细胞增殖的作用

来源:学术堂 作者:姚老师
发布于:2014-05-20 共4385字
论文摘要

  0 引言

  吸烟与很多疾病的发生密切相关,烟草中的尼古丁类有害成分可致皮肤松弛。吸烟引起的皮肤松弛表现为毛孔突显、面部轮廓变模糊、皮肤松弛下垂等。尼古丁是烟草植物合成的杂环类水溶性生物碱,俗称烟碱,易透过生物膜和血脑屏障而使人成瘾。

  人体通过口鼻和支气管黏膜吸收尼古丁后,会出现如心跳加速、呼吸变快、血压升高、精神状况改变等症状。尼古丁的半衰期约为2h。

  尼古丁是乙酰胆碱受体激动剂,经尼古丁型乙酰胆碱受体(nAChR)介导而发挥作用。nAChR是一种相对分子质量为290kDa的蛋白质,最初发现表达于神经肌肉间突触;深入研究表明,整个外周和中枢神经系统以及非神经细胞均表达nAChR。nAChR具有一个特征性的同五聚体环结构跨膜区,环结构的中心为离子通道。已发现αl~αl0、βl~β4、γ、δ和ε等17种nAChR亚单位,它们的组成差异决定离子通道的功能。其中,αl0亚单位不能单独形成功能受体,当其与α9组成型受体共同作用时,可产生强大的乙酰胆碱激发电流,表明αl0亚基可调节α9亚基型受体的生理学特性,两种亚单位共同组成一个功能型受体。电生理学与免疫组化研究表明,人类神经纤维表达的nAChR主要由α3、α5或β4亚基的同五聚体组成。据报道,尼古丁可能通过激活α7胆碱受体而发挥保护神经的作用。此外,nAChR的表达并不局限于神经末梢,研究发现皮肤组织也表达nAChR和毒覃碱型乙酰胆碱受体(mAChR);人胚皮肤成纤维细胞(Human Embryonic Fibroblast,hEF)表达特异性nAChR。

  皮肤松弛是常见的皮肤衰老现象,可由自然因素和/或非自然因素引起。大量研究证实,皮肤松弛始于皮肤真皮的成纤维细胞特有的生物学特性改变;皮肤皱褶、皮肤变薄与真皮成纤维细胞生长异常密切相关。皮肤老化程度与吸烟量及吸烟持续时间正相关。尼古丁能改变成纤维细胞的组织重塑功能及nAChRs的结构和功能,从而引起皮肤细胞外基质中特定成分减少。香烟烟雾提取物和尼古丁对hEF的损伤效应的研究结果表明,香烟烟雾提取物可致hEF呈典型的损伤细胞形态,并抑制细胞生长和诱导细胞G1、G2期停滞;但是,微量尼古丁(低于1mmol/L)则可促进培养的hEF增殖。所以,目前尼古丁对hEF增殖的作用尚未明确。

  hupo胆碱是尼古丁受体阻断剂,它能与尼古丁受体结合而使尼古丁丧失对nAChR的刺激效应,是一种除极性肌松药,hupo胆碱可阻断神经细胞中nAChR表达而用作止痛药和麻醉辅助剂。由琥珀酰氯和氯化胆碱在一定条件下反应制取的氯化hupo胆碱(SuccinylcholineChloride,SC)注射液是医学上常用的一种骨骼肌松弛剂。然而,尚未证明SC能阻断皮肤中nAChR的表达而缓解尼古丁的皮肤损伤作用。

  本研究经分别分析尼古丁及其受体阻断剂———氯化hupo胆碱对人胚皮肤成纤维细胞增殖的影响,旨在发现吸烟对皮肤成纤维细胞的损伤效应及氯化hupo胆碱的潜在效能,为深入研究氯化hupo胆碱的皮肤保护效应及其美容功效提供实验依据。

  1、材料与方法

  1.1细胞培养

  采用补充10%新生牛血清的DMEM培养基培养hEF(细胞株取自医学遗传学国家重点实验室),胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞、以10000个/100μL接种96孔板,分别加入不同浓度的尼古丁和氯化hupo胆碱培养。

  1.2细胞增殖分析

  本研究采用的噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)比色法是常用的检测细胞存活的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为非水溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DimethylSulfoxide,DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等,具有灵敏度高、经济适用等特点。

  细胞种板后,设置正常生长的细胞为对照组,其余组按浓度添加:尼古丁(昆明伊普瑞斯科技有限公司)(共8个浓度):10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1mol/L;SC(上海旭东海普药业有限公司)(共8个浓度):10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1mol/L;10-3mol/L尼古丁和SC(共5个浓度):10-6、10-5、10-4、10-3和10-2mol/L;10-7mol/L尼古丁和SC(共5个浓度):10-6、10-5、10-4、10-3和10-2mol/L;继续培养24h。吸除每孔液体并用磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSolution,PBS)洗细胞一遍,再加入100μLPBS和20μL0.5%MTT溶液,作用4h。吸除每孔液体,各加入150μLDMSO,震荡混匀10min。以对照组调零测A490;计算细胞存活率(实验组A值/对照组A值)。

  1.3数据分析设置平行组,重复6次,计量资料以平均值±标准差(x-±SD)表示。

  2、结果

  2.1尼古丁对皮肤成纤维细胞增殖的影响与对照组比较,hEF在10-8~10-6mol/L尼古丁作用下,存活率升高,说明该浓度尼古丁对hEF增殖具有促进作用;10-5~10-1mol/L尼古丁作用下,存活率明显降低,说明该浓度尼古丁对hEF增殖具有抑制作用(见图1)。

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  2.2氯化hupo胆碱对皮肤成纤维细胞增殖的影响仅10-8mol/LSC作用后hEF存活率远低于对照组存活率,其余浓度SC作用后细胞存活率均与对照组无显著差异。说明10-8mol/LSC对hEF增殖具有抑制作用;10-7~10-1mol/LSC对hEF增殖的影响不明显,仅呈现随着浓度增高其细胞增殖的促进作用增强的趋势(见图2)。

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  2.3氯化hupo胆碱对尼古丁作用的影响10-6~10-2mol/LSC与10-3mol/L尼古丁共同作用于hEF,仅10-4mol/LSC共同作用时细胞存活率大于10-3mol/L尼古丁单独作用时的存活率。说明10-4mol/LSC能降低尼古丁对hEF增殖的抑制作用,而其余浓度SC却与尼古丁协同抑制hEF增殖(见图3)。10-6~10-2mol/LSC与10-7mol/L尼古丁共同作用于hEF,细胞存活率均小于10-7mol/L尼古丁单独作用时的存活率,说明SC能减弱尼古丁对hEF增殖的促进作用(见图3)。

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  3、讨论

  本研究采用MTT法依次检测了尼古丁和SC对hEF增殖的影响,以及SC对尼古丁作用的影响。结果表明,高浓度尼古丁抑制hEF增殖;而低浓度尼古丁则促进细胞增殖,这种趋势与钱革等采用尼古丁原代培养hEF以观察其损伤效应的结果相符。临床上用于维持肌松的SC浓度为(7.55~1.51)mmol/L,本实验证明该浓度SC对hEF增殖无不良影响,因此可以作为尼古丁受体阻断剂进行其对尼古丁作用的检测。10-6~10-2mol/LSC能减弱尼古丁对hEF增殖的作用(抑制或促进)。其中,10-4mol/LSC能明显缓解尼古丁对hEF增殖的抑制作用,且该浓度处于临床上使用SC的浓度范围内,提示了10-4mol/LSC可以用于缓解皮肤松弛。

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  在进一步分析SC对尼古丁作用的影响的实验中,可加入正常培养的细胞作为对照组,以估测SC对尼古丁作用的强度。检测SC是否能逆转尼古丁的抑制作用而使hEF增殖由受损变为受益,或SC仅缓解尼古丁的抑制作用但仍使hEF增殖受损;检测SC是否虽削弱尼古丁的促进作用但仍使hEF增殖受益,或SC能逆转尼古丁的促进作用而导致hEF增殖受损。基于已有及后期成果,SC有望成为具有抗皮肤松弛的香烟添加剂成分,在特定浓度下发挥缓解尼古丁损伤皮肤作用的功效,为减少吸烟对人体皮肤的损伤提供新思路。

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