尼古丁及其受体阻断剂对人胚皮肤成纤维细胞增殖的作用

　　0　引言

　　吸烟与很多疾病的发生密切相关，烟草中的尼古丁类有害成分可致皮肤松弛。吸烟引起的皮肤松弛表现为毛孔突显、面部轮廓变模糊、皮肤松弛下垂等。尼古丁是烟草植物合成的杂环类水溶性生物碱，俗称烟碱，易透过生物膜和血脑屏障而使人成瘾。

　　人体通过口鼻和支气管黏膜吸收尼古丁后，会出现如心跳加速、呼吸变快、血压升高、精神状况改变等症状。尼古丁的半衰期约为2h。

　　尼古丁是乙酰胆碱受体激动剂，经尼古丁型乙酰胆碱受体(nAChR)介导而发挥作用。nAChR是一种相对分子质量为290kDa的蛋白质，最初发现表达于神经肌肉间突触;深入研究表明，整个外周和中枢神经系统以及非神经细胞均表达nAChR。nAChR具有一个特征性的同五聚体环结构跨膜区，环结构的中心为离子通道。已发现αl～αl0、βl～β4、γ、δ和ε等17种nAChR亚单位，它们的组成差异决定离子通道的功能。其中，αl0亚单位不能单独形成功能受体，当其与α9组成型受体共同作用时，可产生强大的乙酰胆碱激发电流，表明αl0亚基可调节α9亚基型受体的生理学特性，两种亚单位共同组成一个功能型受体。电生理学与免疫组化研究表明，人类神经纤维表达的nAChR主要由α3、α5或β4亚基的同五聚体组成。据报道，尼古丁可能通过激活α7胆碱受体而发挥保护神经的作用。此外，nAChR的表达并不局限于神经末梢，研究发现皮肤组织也表达nAChR和毒覃碱型乙酰胆碱受体(mAChR);人胚皮肤成纤维细胞(Human　Embryonic　Fibroblast，hEF)表达特异性nAChR。

　　皮肤松弛是常见的皮肤衰老现象，可由自然因素和/或非自然因素引起。大量研究证实，皮肤松弛始于皮肤真皮的成纤维细胞特有的生物学特性改变;皮肤皱褶、皮肤变薄与真皮成纤维细胞生长异常密切相关。皮肤老化程度与吸烟量及吸烟持续时间正相关。尼古丁能改变成纤维细胞的组织重塑功能及nAChRs的结构和功能，从而引起皮肤细胞外基质中特定成分减少。香烟烟雾提取物和尼古丁对hEF的损伤效应的研究结果表明，香烟烟雾提取物可致hEF呈典型的损伤细胞形态，并抑制细胞生长和诱导细胞G1、G2期停滞;但是，微量尼古丁(低于1mmol/L)则可促进培养的hEF增殖。所以，目前尼古丁对hEF增殖的作用尚未明确。

　　hupo胆碱是尼古丁受体阻断剂，它能与尼古丁受体结合而使尼古丁丧失对nAChR的刺激效应，是一种除极性肌松药，hupo胆碱可阻断神经细胞中nAChR表达而用作止痛药和麻醉辅助剂。由琥珀酰氯和氯化胆碱在一定条件下反应制取的氯化hupo胆碱(SuccinylcholineChloride，SC)注射液是医学上常用的一种骨骼肌松弛剂。然而，尚未证明SC能阻断皮肤中nAChR的表达而缓解尼古丁的皮肤损伤作用。

　　本研究经分别分析尼古丁及其受体阻断剂———氯化hupo胆碱对人胚皮肤成纤维细胞增殖的影响，旨在发现吸烟对皮肤成纤维细胞的损伤效应及氯化hupo胆碱的潜在效能，为深入研究氯化hupo胆碱的皮肤保护效应及其美容功效提供实验依据。

　　1、材料与方法

　　1．1细胞培养

　　采用补充10%新生牛血清的DMEM培养基培养hEF(细胞株取自医学遗传学国家重点实验室)，胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞、以10000个/100μL接种96孔板，分别加入不同浓度的尼古丁和氯化hupo胆碱培养。

　　1．2细胞增殖分析

　　本研究采用的噻唑蓝(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT)比色法是常用的检测细胞存活的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为非水溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DimethylSulfoxide，DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，具有灵敏度高、经济适用等特点。

　　细胞种板后，设置正常生长的细胞为对照组，其余组按浓度添加:尼古丁(昆明伊普瑞斯科技有限公司)(共8个浓度):10－8、10－7、10－6、10－5、10－4、10－3、10－2和10－1mol/L;SC(上海旭东海普药业有限公司)(共8个浓度):10－8、10－7、10－6、10－5、10－4、10－3、10－2和10－1mol/L;10－3mol/L尼古丁和SC(共5个浓度):10－6、10－5、10－4、10－3和10－2mol/L;10－7mol/L尼古丁和SC(共5个浓度):10－6、10－5、10－4、10－3和10－2mol/L;继续培养24h。吸除每孔液体并用磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSolution，PBS)洗细胞一遍，再加入100μLPBS和20μL0．5%MTT溶液，作用4h。吸除每孔液体，各加入150μLDMSO，震荡混匀10min。以对照组调零测A490;计算细胞存活率(实验组A值/对照组A值)。

　　1．3数据分析设置平行组，重复6次，计量资料以平均值±标准差(x－±SD)表示。

　　2、结果

　　2．1尼古丁对皮肤成纤维细胞增殖的影响与对照组比较，hEF在10－8～10－6mol/L尼古丁作用下，存活率升高，说明该浓度尼古丁对hEF增殖具有促进作用;10－5～10－1mol/L尼古丁作用下，存活率明显降低，说明该浓度尼古丁对hEF增殖具有抑制作用(见图1)。

　　2．2氯化hupo胆碱对皮肤成纤维细胞增殖的影响仅10－8mol/LSC作用后hEF存活率远低于对照组存活率，其余浓度SC作用后细胞存活率均与对照组无显著差异。说明10－8mol/LSC对hEF增殖具有抑制作用;10－7～10－1mol/LSC对hEF增殖的影响不明显，仅呈现随着浓度增高其细胞增殖的促进作用增强的趋势(见图2)。

　　2．3氯化hupo胆碱对尼古丁作用的影响10－6～10－2mol/LSC与10－3mol/L尼古丁共同作用于hEF，仅10－4mol/LSC共同作用时细胞存活率大于10－3mol/L尼古丁单独作用时的存活率。说明10－4mol/LSC能降低尼古丁对hEF增殖的抑制作用，而其余浓度SC却与尼古丁协同抑制hEF增殖(见图3)。10－6～10－2mol/LSC与10－7mol/L尼古丁共同作用于hEF，细胞存活率均小于10－7mol/L尼古丁单独作用时的存活率，说明SC能减弱尼古丁对hEF增殖的促进作用(见图3)。

　　3、讨论

　　本研究采用MTT法依次检测了尼古丁和SC对hEF增殖的影响，以及SC对尼古丁作用的影响。结果表明，高浓度尼古丁抑制hEF增殖;而低浓度尼古丁则促进细胞增殖，这种趋势与钱革等采用尼古丁原代培养hEF以观察其损伤效应的结果相符。临床上用于维持肌松的SC浓度为(7．55～1．51)mmol/L，本实验证明该浓度SC对hEF增殖无不良影响，因此可以作为尼古丁受体阻断剂进行其对尼古丁作用的检测。10－6～10－2mol/LSC能减弱尼古丁对hEF增殖的作用(抑制或促进)。其中，10－4mol/LSC能明显缓解尼古丁对hEF增殖的抑制作用，且该浓度处于临床上使用SC的浓度范围内，提示了10－4mol/LSC可以用于缓解皮肤松弛。

　　在进一步分析SC对尼古丁作用的影响的实验中，可加入正常培养的细胞作为对照组，以估测SC对尼古丁作用的强度。检测SC是否能逆转尼古丁的抑制作用而使hEF增殖由受损变为受益，或SC仅缓解尼古丁的抑制作用但仍使hEF增殖受损;检测SC是否虽削弱尼古丁的促进作用但仍使hEF增殖受益，或SC能逆转尼古丁的促进作用而导致hEF增殖受损。基于已有及后期成果，SC有望成为具有抗皮肤松弛的香烟添加剂成分，在特定浓度下发挥缓解尼古丁损伤皮肤作用的功效，为减少吸烟对人体皮肤的损伤提供新思路。

　　参考文献( References) :
　　［1］ Ortiz A，Grando S A． Smoking and the skin ［J］． International Journal of Dermatology，2012，51( 3) : 250-262．
　　［2］ Baker L K，Mao D，Chi H，et al． Intermittent nicotine exposure upregulates nAChRs in VTA dopamine neurons and sensitises locomotor responding to the drug ［J］． European Journal of
Neuroscience，2013，37( 6) : 1004-1011．
　　［3］ Hammer T R，Fischer K，Mueller M，et al． Effects of cigarette smoke residues from textiles on fibroblasts，neurocytes and zebrafish embryos and nicotine permeation through human skin ［J］．
International Journal of Hygiene and Environmental Health，2011，214: 384-391．
　　［4］ Holtman J R，Dwoskin L P，Dowell C，et al． The novel small molecule α9 α10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic ［J］． European Journal of Pharmacology，2011，670: 500-508．
　　［5］ Costa R，Motta E M，Manjavachi M N，et al． Activation of the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor ( α7 nAchR ) reverses referred mechanical hyperalgesia induced by colonic inflammation in
mice ［J］． Neuropharmacology，2012，63( 5) : 798-805．
　　［6］ Akinori A， Yuki T， Toshiaki K， et al． Mechanisms of Neuroprotective Effects of Nicotine and Acetylcholinesterase Inhibitors: Role of α4 and α7 Receptors in Neuroprotection ［J］．Journal of Molecular Neuroscience，2010，40( 1-2) : 211-216．
　　［7］ Grando S A，Horton R M， Pereira E F， et al． A nicotinic acetylcholine receptor regulating cell adhesion and motility is expressed in human keratinocytes ［J］． Journal of Investigative　Dermatology，1995，105( 6) : 774-781．
　　［8］ Gill J F，Yu S S，Neuhaus I M． Tobacco smoking and dermatologic surgery ［J］． Journal of the American Academy of Dermatology，2013( 68) : 167-172．
　　［9］ Ishiwata T，Seyama K，Hirao T，et al． Improvement in skin color achieved by smoking cessation ［J］． International Journal of Cosmetic Science，2013，35( 2) : 191-195．
　　［10］ Choi J E，Kim J N，Jeong S H，et al． Nicotine induces the expression of early growth response-1 in human skin dermal fibroblasts ［J］． International Journal of Dermatology，2010，49( 2) : 158-161．
　　［11］ 钱 革，蒋法兴，陶小华，等． 尼古丁与皮肤健康［J］． 国际皮肤性病学杂志，2007，33( 6) : 366-368．of Dermatology and Venereology，
　　［12］ 钱 革，蒋法兴，周武庆，等． 香烟烟雾提取物致体外皮肤成纤维细胞损伤和对胶原合成的影响 ［J］． 中国康复理论与实践，2007，13( 5) : 440-443．
　　［13］ Kawabata H，Kanekura T，Gushi A，et al． Successful treatment of digital ulceration in Buerger ’s disease with nicotine chewing gum ［J］． British Journal of Dermatology，1999，140( 1) : 187-188．
　　［14］ 郑洪国，宁张磊，梁立娜，等． 离子色谱法检测氯化hupo胆碱注射液中的氯化胆碱的含量［J］． 药物分析杂志，2009，29( 12) :2147-2149．
　　［15］ Ferrari M，Fornasiero M C，Isetta A M． MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity in vitro ［J］． Journal of Immunological Methods，1990，131( 2) : 165-172．
　　［16］ Gerlier D，Thomasset N． Use of MTT assay to measure cell activation ［J］． Journal of Immunological Methods，1986，94( 1-2) :57-63．